El término bio-ladrillo (o BioBrick ) se usa en biología sintética para denotar una secuencia de ADN que se ajusta a un ensamblaje estándar por enzima de restricción . Los bioladrillos se utilizan como bloques de construcción para diseñar conjuntos de ladrillos individuales o grupos de ladrillos que luego se pueden integrar en células vivas (como la bacteria Escherichia coli ) para construir nuevos sistemas biológicos. Ejemplos de BioBrick son promotores , sitios de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes y terminadores .
Los elementos "BioBricks" se utilizan aplicando los principios de ingeniería de abstracción y modularización. Los bio-ladrillos forman la base del sistema jerárquico en el que se basa la biología sintética ; con tres niveles de jerarquía:
El desarrollo de una estandarización de "partes biológicas" permite un rápido ensamblaje de secuencias. La capacidad de identificar y caracterizar de forma independiente diferentes piezas y dispositivos también mejora la fiabilidad de los sistemas de orden superior.
El primer intento de crear una lista de "partes biológicas estandarizadas" se remonta a 1996 y fue realizado por Rebatchouk et al ., Un equipo que presentó una estrategia de clonación para el ensamblaje de fragmentos cortos de ADN. Pero este primer intento no fue realmente reconocido por la comunidad científica de la época. En 1999, Arkin y Endy se dieron cuenta de que los elementos heterogéneos utilizados para producir "circuitos genéticos" carecían de estandarización. Por lo tanto, propusieron una primera lista de partes biológicas estándar. estos bioladrillos fueron descritos y presentados por Tom Chevalier en el MIT en 2003. Desde entonces, varios grupos de investigación han utilizado estos bioladrillos para crear nuevos dispositivos y sistemas mediante ingeniería genética (biología sintética).
Una fundación llamada "BioBricks Foundation" fue creada en 2006 por ingenieros y científicos como una asociación no comercial con el objetivo de estandarizar las "partes biológicas" utilizadas o utilizables por la biología sintética. La Fundación se enfoca en Tecnología, Derecho y Educación al servicio de la biología sintética . La Fundación también alberga SBx.0, un programa educativo y técnico que busca expandirse en todo el mundo. Sus programas técnicos están dirigidos a la producción de una serie de ladrillos biológicos estándar. Además, los programas tienen como objetivo generalizar la enseñanza de estas técnicas y ayudar al surgimiento de fuentes abiertas y estandarizadas de "partes biológicas".
Como alternativa a los sistemas tradicionales de patentes biotecnológicas, y en un esfuerzo por hacer ampliamente disponibles "ladrillos biológicos" estandarizados y utilizables por una comunidad de código abierto, la Fundación ha producido un acuerdo llamado "Acuerdo Público de BioBricks" (BPA). Este acuerdo constituye un marco legal que permite a los usuarios tener reconocida su paternidad de invención al reutilizar bio-ladrillos, mencionar la existencia o no de una patente sobre combinaciones de bio-ladrillos, y construir libremente sobre la base de contribuciones de otros usuarios, cada uno comprometiéndose a no reclamar ningún derecho de propiedad sobre los componentes reutilizados.
El estándar denominado "estándar BioBrick Assembly" es un estándar creado para superar la falta de estandarización de los métodos tradicionales de clonación molecular y para facilitar el trabajo abierto y colaborativo a escala internacional. Mejora la fiabilidad de las combinaciones de ladrillos básicos para formar compuestos biomoleculares. También permite a grupos remotos de biólogos sintéticos de todo el mundo reutilizar los bioladrillos sin tener que (re) pasar por ningún ciclo de diseño y manipulación. Esto significa que un nuevo ladrillo (o un nuevo conjunto) puede ser utilizado inmediatamente por otros equipos de investigadores o industriales, y cada vez con mayor facilidad. Además, en comparación con el antiguo método de clonación ad hoc , el proceso que utiliza el "estándar de ensamblaje BioBrick" es más rápido y promueve la automatización, este estándar es el primero de su tipo creado en este campo. Desde entonces, se han desarrollado varios otros estándares de montaje, como el "estándar de biofusión" y el "estándar de Friburgo".
Este nuevo estándar, desarrollado por Tom Knigh, es el más utilizado entre los estándares de montaje. Implica el uso de enzimas de restricción . Cada Bio-brick es una secuencia de ADN que es transportada por un plásmido circular , que se utiliza como vector. Este vector actúa como un sistema de transporte para mover el bio-ladrillo. El primer enfoque en esta dirección fue la introducción de secuencias estándar, secuencias de "prefijo" y "sufijo" respectivamente en los extremos 5 'y 3' de una secuencia de ADN. Estas secuencias estándar codifican sitios específicos para la enzima de restricción. El prefijo codifica los sitios EcoRI (E) y Xbal (X), mientras que el sufijo codifica los sitios SpeI (S) y PstI (P). Estos prefijos y sufijos no se consideran parte del bio-ladrillo. Para facilitar el proceso de ensamblaje, los bio-ladrillos en sí no deben contener ninguno de estos sitios de restricción. Durante el ensamblaje de dos ladrillos diferentes, uno de los plásmidos se digiere con EcoRI y SpeI . El plásmido que lleva el otro bio-ladrillo se digiere con EcoRI y Xbal . Esto deja dos plásmidos con 4 pares de bases (pb) en los extremos 5 'y 3'. Los sitios EcoRI lo vincularán porque son complementarios entre sí. Los sitios XbaI y Spel también estarán vinculados porque la "digestión" deja extremos compatibles. Entonces, los dos ladrillos de ADN se encuentran en el mismo plásmido. La ligadura da un área de "cicatriz" de 8 pares de bases entre los dos bio-ladrillos. Como el sitio de la cicatriz es un sitio híbrido XbaI y SpeI , no es reconocido por la enzima de restricción. Las secuencias de prefijos y sufijos permanecen inalteradas por este proceso de digestión y "pegado", que permite nuevas etapas de ensamblaje con más bio-ladrillos.
Este método de ensamblaje es un proceso idempotente : múltiples aplicaciones no cambian el producto final y mantienen el prefijo y el sufijo. Sin embargo, si el ensamblaje de bio-ladrillos estándar permite la formación de módulos funcionales, el estándar 10 tiene límites. El sitio de la cicatriz de 8 pares de bases (pb) no permite la creación de una verdadera proteína de fusión . El sitio de la cicatriz provoca un cambio ribosómico (también conocido como cambio del marco de lectura) que impide la lectura continua de codones, que es necesaria para la formación de una proteína de fusión.
Tom Knight luego (en 2008) desarrolló un protocolo (estándar de ensamblaje BB-2) para abordar este problema, utilizando otras enzimas para la digestión de la primera parte; son casi iguales pero con prefijos y sufijos modificados.
El "estándar de montaje BglBrick" es otro estándar propuesto por J. Christopher Anderson, John E. Dueber, Mariana Leguia, Gabriel C. Wu, Jonathan C. Goler, Adam P. Arkin y Jay D. Keasling en septiembre de 2009. Este es un método que permite la fusión múltiple de dominios proteicos de ladrillos biológicos sin modificar el marco de lectura o introducir codones de parada. Este método crea una cicatriz GGATCT que luego puede ensamblarse con otro método.
El laboratorio de Pam Silver creó este otro estándar para superar el problema de la formación de una proteína de fusión. Este estándar de ensamblaje también se conoce como Biofusion. Esta es una mejora del "" Conjunto estándar 10 de BioBrick ""; implica la eliminación de un nucleótido del sitio XbaI y SpeI , lo que reduce la cicatriz en 2 nucleótidos, lo que permite formar ahora una secuencia de cicatriz de 6 pares de bases (pb). Este último permite mantener el marco de lectura. La secuencia de la cicatriz codifica el aminoácido treonina (ACT) y arginina (AGA). Esta ligera mejora permite la formación de una proteína de fusión en el marco. Sin embargo, la arginina es un aminoácido cargado, lo que es una desventaja para las técnicas de ensamblaje de biofusión: estas propiedades de la arginina inducen la desestabilización de las proteínas de acuerdo con el principio de la "regla del extremo N".
Un equipo que participó en IGEM en 2007 introdujo este nuevo estándar de ensamblaje para superar los inconvenientes del enfoque de Biofusion .
Ella creó un nuevo conjunto de secuencias de prefijos y sufijos agregando sitios de enzimas de restricción, AgeI y NgoMIV, respectivamente, al prefijo y sufijo existentes. Estos sitios de enzimas de restricción recientemente introducidos son compatibles con los estándares de bio-ladrillos. El estándar de Friburgo todavía produce un sitio de cicatriz de 6 pb, pero la secuencia de cicatriz (ACCGGC) ahora codifica treonina y glicina respectivamente . Esto da como resultado una proteína mucho más estable porque la glicina forma un N-terminal estable (extremo amino) , a diferencia de la arginina que induce la degradación de este mismo extremo.
Se utilizan diferentes métodos para ensamblar ladrillos biológicos. A veces, esto se debe a que algunos estándares requieren materiales y métodos diferentes (mediante el uso de diferentes enzimas de restricción) y, a veces, a preferencias en el protocolo, ya que algunos métodos de ensamblaje son más eficientes o más fáciles de implementar que otros.
El método 3A es el más utilizado, ya que es compatible con los métodos mencionados anteriormente.
Este método de ensamblaje comprende dos bio-ladrillos y un plásmido de destino. Este último contiene un gen tóxico (letal), para facilitar la elección de un plásmido correctamente ensamblado. El plásmido de destino también tiene otro gen de resistencia a los antibióticos, diferente de los de los plásmidos que llevan los bio-ladrillos. Estos tres plásmidos se digieren todos con la enzima de restricción apropiada y luego se pueden ligar. Solo los ensamblajes correctos producirán un compuesto viable en el plásmido de destino.
El método de inserción amplificada es independiente de las secuencias de prefijos y sufijos, lo que permite su uso en combinación con la mayoría de estándares de ensamblaje. También tiene una tasa de transformación más alta que el método 3A y no requiere que los plásmidos tengan diferentes genes de resistencia a antibióticos. Este método utiliza PCR antes de la digestión y antes de tratar la mezcla con la enzima de restricción DpnI, que digiere el ADN metilado como plásmidos. Al eliminar los plásmidos molde con DpnI, solo queda el inserto para amplificarlo mediante PCR.
El método de ensamblaje conocido como "Gibson sin cicatriz" (sin cicatriz) permite la unión simultánea de varios bio-ladrillos. Este método requiere que la secuencia deseada tenga una superposición de 20 a 150 pares de bases . Como los ladrillos biológicos no tienen esta superposición, el método requiere cebadores de PCR para crear salientes entre los ladrillos biológicos. La exonucleasa T5 permite que se creen hebras simples de ADN en los extremos de ciertas secuencias. Luego, una polimerasa agrega segmentos de ADN a las vacantes y una ligasa Taq puede sellar las hebras finales.
El grupo MIT liderado por Tom Knight que desarrolló los ladrillos biológicos y la competencia de las Máquinas de Ingeniería Genética Internacional (iGEM) es también el creador del registro de ladrillos ( Registry of Standard Biological Parts ) que se ha convertido en uno de los principales pilares de la tecnología sintética. biología. Proporciona información disponible para todos en la web, con datos sobre más de 20.000 " BioBricks ". El Registro contiene:
Cada bio-ladrillo tiene un código de identificación único que facilita su búsqueda (por ejemplo, BBa_J23100 designa un promotor constitutivo). El registro es de libre acceso y cualquiera puede enviarle un bio-ladrillo. La mayoría de los BioBricks son presentados por estudiantes que participan en el evento anual iGEM, una competencia que se lleva a cabo todos los veranos. El Registro permite el intercambio de datos y documentos en línea, lo que facilita una rápida reutilización y modificación de ensamblajes por parte de la comunidad participante.
También se han desarrollado registros destinados a profesionales. Como la mayoría de los "BioBricks" han sido descritos por estudiantes en la competencia iGEM, su caracterización, datos y metadatos pueden faltar, sin embargo, esta caracterización es esencial cuando se trata de diseñar o modelar componentes funcionales. Un ejemplo de registro profesional lo construyó el establecimiento público estadounidense The International Open Facility Advancing Biotechnology (BIOFAB), que contiene descripciones detalladas de cada parte biológica. También es de código abierto y está disponible comercialmente. BIOFAB tiene como objetivo catalogar con bioladrillos de alta calidad para satisfacer las necesidades de la comunidad profesional de la biología sintética.
La Fundación BioBrick (BBF) es una organización de interés público creada para promover el uso de bio-ladrillos estandarizados en los campos y en poco tiempo superando la competencia iGEM.
La BBF trabaja actualmente para mejorar sus recursos, con el objetivo de hacerlos accesibles de forma gratuita para todos.