Una enzima de restricción es una proteína capaz de cortar un fragmento de ADN en una secuencia de nucleótidos característica llamada sitio de restricción . Cada enzima de restricción reconoce así un sitio específico. Actualmente se conocen varios cientos de enzimas de restricción.
Presentes de forma natural en una gran cantidad de especies de bacterias , estas enzimas se han convertido en herramientas importantes en la ingeniería genética .
Las enzimas de restricción producidas por bacterias constituyen un mecanismo de defensa contra las infecciones por bacteriófagos , virus específicos de las bacterias. Cuando el virus inyecta su ADN en la bacteria, la enzima de restricción lo corta en sus sitios específicos. Por tanto, la destrucción del genoma del virus bloquea la infección. El nombre de enzima de restricción proviene de este mecanismo: la presencia de estas enzimas en las bacterias restringe la infectividad de los bacteriófagos.
Para evitar que la enzima de restricción corte el ADN de su propio genoma, las bacterias también producen una segunda enzima llamada metilasa , que también reconoce el sitio de restricción. La metilasa no corta el ADN, pero lo modifica agregando un grupo metilo a uno o más nucleótidos del sitio. Esta metilación evita la escisión por la enzima de restricción.
Este mecanismo de defensa, llamado sistema de restricción / modificación, asocia sistemáticamente estas dos enzimas, una para cortar y la otra para proteger.
Las enzimas de restricción pertenecen a la clase de endonucleasas , es decir, enzimas capaces de escindir los enlaces fosfodiéster entre dos nucleótidos dentro de la cadena de un ácido nucleico, y más específicamente pertenecen a la clase de endodesoxirribonucleasas ya que son específicas del ADN. Las endonucleasas se diferencian de las exonucleasas en que pueden escindir cadenas de ácido nucleico internamente, mientras que las exonucleasas atacan la molécula de ácido nucleico solo en sus extremos.
Las enzimas de restricción son capaces de reconocer específicamente y solo una secuencia de ADN corta de 4-10 pares de bases, y escindir ambas cadenas del dúplex de ADN en el sitio reconocido. Esta propiedad se ha utilizado durante mucho tiempo en biología molecular , ya que permiten que el ADN se fragmente en segmentos de tamaño reducido mediante el corte en sitios definidos.
Las enzimas de restricción se pueden usar para construir un mapa genético (llamado "mapa de restricción") de una molécula de ADN. El mapa de restricción da el orden de los sitios de restricción a lo largo de esta molécula y el tamaño de los fragmentos producidos. Esta técnica de caracterización de ácidos nucleicos, ampliamente utilizada hace veinte años, ha sido suplantada por la secuenciación directa, que se ha vuelto mucho menos costosa y se realiza de forma rutinaria.
También se pueden usar para hacer que las células huésped (por ejemplo, la bacteria Escherichia coli ) produzcan una proteína exógena . Las enzimas de restricción juegan un papel crucial en este proceso porque permiten, al cortar la hebra en una ubicación específica y asimétricamente, la integración de una hebra de ADN específica que codifica una proteína específica en un plásmido con el fin de expresarla en una bacteria . Esta integración se puede hacer, aprovechando la asimetría creada por la enzima de restricción, jugando con la homología de secuencia en el sitio de escisión == sitio de integración.
Dependiendo de la relación espacial entre la secuencia reconocida y el sitio de escisión, es posible distinguir tres tipos de enzimas de restricción.
Las enzimas de tipo I y de tipo III reconocen una secuencia de ADN específica y cortan en una ubicación aleatoria, con una separación de aproximadamente 1000 pares de bases (pb) para el tipo I y 25 pb para el tipo III más allá del sitio de restricción. Estos 2 tipos también tienen actividad metilasa además de su actividad endonucleasa, lo que los diferencia del tipo II.
Las enzimas de tipo II más utilizadas reconocen una secuencia específica y cortan en una ubicación específica en esta secuencia. A continuación se muestran algunos ejemplos de estas enzimas.
Generalmente, las enzimas de restricción son bloqueadas por monoazida de etidio.
La nomenclatura de las enzimas de restricción es precisa. Su nombre tiene 3 o 4 letras que corresponden entre otras a la bacteria de la que se extrajo esta enzima:
Así tenemos E co R I: enzima de restricción de E scherichia (género) co li (especie) cepa R Y317 la primera en ser caracterizada ( I )
| Enzima | Fuente | Secuencia reconocida | Cortar | Termina (después del corte) |
| Eco RI | Escherichia coli |
5 ' GAATTC 3' CTTAAG |
5 '--- G AATTC --- 3' 3 '--- CTTAA G --- 5' |
Cohesivo |
| BamHI | Bacillus amyloliquefaciens | 5'GGATCC 3'CCTAGG |
5 '--- G GATCC --- 3' 3 '--- CCTAG G --- 5' |
Cohesivo |
| HindIII | Haemophilus influenzae | 5'AAGCTT 3'TTCGAA |
5 '--- A AGCTT --- 3' 3 '--- TTCGA A --- 5' |
Cohesivo |
| MstII | Especies de microcoleus | 5'CCTMAGG 3'GGAMTCC |
5 '--- CC TNAGG --- 3' 3 '--- GGAMT CC --- 5' |
Cohesivo |
| TaqI | Thermus aquaticus | 5'TCGA 3'AGCT |
5 '--- T CGA --- 3' 3 '--- AGC T --- 5' |
Cohesivo |
| NotI | Nocardia otitidis | 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG |
5 '- GC GGCCGC - 3'
3 '- CGCCGG CG - 5' |
Cohesivo |
| HinfI | Haemophilus influenzae | 5'GANTC 3'CTNAG |
||
| A él | Arthrobacter luteus | 5'AGCT 3'TCGA |
5 '--- AG CT --- 3' 3 '--- TC GA --- 5' |
Franco |
| BgIIII | Bacillus globigii | 5'AGATCT 3'TCTAGA |
5 '--- A GATCT --- 3' 3 '--- TCTAG A --- 5' |
Cohesivo |
| HaeIII | Haemophilus aegyptius | 5'GGCC 3'CCGG |
5 '--- GG CC --- 3' 3 '--- CC GG --- 5' |
Franco |
| HhaI | Haemophilus haemolyticus | 5'GCGC 3'CGCG |
5 '--- GCG C --- 3' 3 '--- C GCG --- 5' |
Cohesivo |
| PstI | Providencia stuartii | 5'CTGCAG 3'GACGTC |
5 '--- CTGCA G --- 3' 3 '--- G ACGTC --- 5' |
Cohesivo |
| SmaI | Serratia marcescens | 5'CCCGGG 3'GGGCCC |
5 '--- CCC GGG --- 3' 3 '--- GGG CCC --- 5' |
Franco |
El N y M en la secuencia de MstII pueden ser reemplazados por una de las 4 bases y su complemento. La secuencia de restricción de MstII es un ejemplo de un palíndromo imperfecto ya que tiene un número impar de pares de bases.
Las digestiones enzimáticas se llevan a cabo generalmente en un microtubo colocado en un baño de agua a una temperatura adecuadamente regulada (generalmente 37ºC) sobre una rejilla flotante.