Estabilización de plásmidos

Los plásmidos son elementos de ADN generalmente circulares y bicatenarios. Se encuentran en muchas bacterias además del genoma bacteriano básico. Su presencia no es a priori necesaria para la supervivencia de su célula huésped, aunque pueden portar genes que codifican funciones aportando ventajas evolutivas como la explotación de un recurso del medio, la síntesis de un elemento. Imprescindible no disponible en el medio o resistencias a un veneno. Si este no es el caso, los plásmidos representan un peso muerto debido al uso de recursos celulares. De hecho, se replican y sus genes se expresan en detrimento parcial de la replicación y expresión del propio genoma de la célula. En ausencia de un factor de selección para la presencia del plásmido, una célula hija que no recibiría una copia de un plásmido durante la división de su célula madre se vería favorecida por tanto dentro de la población .

Con respecto a las bacterias , se observa que la mayoría contienen uno o más plásmidos en estado salvaje incluso en ausencia de algún factor ambiental favorable para su mantenimiento. Este mantenimiento (o estabilización) de un plásmido en una población explota, por tanto, otros principios.

La replicación de un plásmido se realiza mediante la maquinaria celular, pero el origen de la replicación y ciertos factores de replicación son específicos del plásmido. El número de copias del plásmido está definido por el propio plásmido. Por tanto, un sistema de estabilización simple consiste en aumentar el número de copias para que su distribución aleatoria permita encontrar algunas en cada célula hija después de la división. De hecho, la probabilidad de que una célula se encuentre sin una copia del plásmido es 2 -n donde n es el número de copias antes de la división. Por tanto, un plásmido presente en 10 copias corre el riesgo de perderse cada 1024 divisiones. Con 20 copias, esta probabilidad se reduce a menos de una posibilidad en un millón (probabilidad aún más reducida por la mayor parte de los plásmidos en la célula). Por raro que sea, esta pérdida sigue siendo una ventaja evolutiva sobre las células que todavía tienen que soportar la carga de veinte plásmidos.

La estabilización de un plásmido de bajo número de copias en la población que lo hospeda requiere otros mecanismos. Estos mecanismos son de diferentes tipos y, a menudo, se combinan en el mismo plásmido para una mayor eficacia. Aquí hay una descripción general.

Resolución de multímeros

Diferentes copias de un plásmido tienen la misma secuencia de ADN . Por tanto, son capaces de ser objeto de recombinaciones homólogas, formando así multímeros de varios plásmidos. Dado que la regulación del número de copias se realiza de acuerdo con el número de orígenes de replicación y el número de plásmidos independientes, la multimerización disminuye el número de unidades totales a distribuir en las células hijas y así aumenta las probabilidades de producir una célula hija. sin una copia de plásmido.

La solución consiste en que el plásmido codifique un sistema de recombinasa (o utilice un sistema de este tipo presente en el cromosoma) que permita la resolución de multímeros en monómeros. El operón parCBA del plásmido bacteriano RK2 es un ejemplo de tal sistema que comprende los genes de la resolvasa ParA, la nucleasa ParB y una proteína de función desconocida, ParC.

Sistemas de particiones activas

Los sistemas de partición están compuestos por secuencias cuya función es similar a la de los centrómeros eucariotas . Algunos modelos sugieren que estas secuencias están unidas por proteínas a elementos únicos presentes en cada célula hija. Estos elementos podrían, por ejemplo, estar ubicados en el cromosoma o la membrana.

Otros modelos proponen el apareamiento de plásmidos por su secuencia centromérica. Estos luego se distribuirían en las células hijas por filamentos o colocando el par en el tabique de formación, un plásmido en cada lado del mismo.

Ejemplos de sistemas de partición activos son parA del plásmido R1 (que no debe confundirse con parA del operón parCBA del plásmido RK2), sop del plásmido F o por el plásmido- profago P1.

Sistemas de veneno-antídoto

Estos sistemas también se denominan módulos de dependencias ( módulos de adicción ), sistemas de muerte programada o sistemas de matanza post-segregacional (PSK o matanza "post-segregacional" no es habitual en francés). Se han identificado en muchos plásmidos de bajo número de copias en bacterias Gram negativas .

En el mismo operón del plásmido se codifica un veneno y un antídoto para este veneno ( Figura 1.A ). El antídoto es relativamente inestable en comparación con el veneno porque se degrada rápidamente por la actividad de una proteasa dependiente de ATP . Por lo tanto, debe mantenerse en una concentración suficiente para contrarrestar el efecto del veneno, que requiere la presencia del plásmido. En efecto, si durante la división una célula hija no recibe una copia del plásmido, el antídoto aún presente en el citoplasma se degrada sin que ya no pueda sintetizarse de novo . Por lo tanto, el veneno puede actuar para matar la célula, de ahí el nombre de muerte post-segregacional ( figura 1.B ). El término "módulo de adicción" se refiere al hecho de que la célula es "adicta" ( adicta ) a su "dosis" de antídoto para sobrevivir.

El antídoto puede ser un antisentido que evita la traducción del ARN mensajero del veneno como en el sistema hok / sok , o una proteína que inhibe la acción de la proteína del veneno formando un complejo con ella. Los sistemas proteína-proteína, con algunas excepciones, tienen algunas características comunes:

el gen del antídoto precede al del veneno en el operón,
las proteínas son pequeñas, del orden de 70 a 85 aminoácidos para el antídoto y de 100 a 130 para el veneno,
la expresión del antídoto es más fuerte que la del veneno,
el veneno es eficaz en dosis muy bajas,
el antídoto forma un fuerte complejo con el veneno,
el antídoto es degradado por una proteasa bacteriana dependiente de ATP específica ( vida media del antídoto: 30 a 60 minutos), mientras que el veneno es estable,
la transcripción del operón es auto-reprimida por el antídoto o el complejo veneno-antídoto,
Las predicciones de estructura secundaria sugieren la presencia de una hebra β corta en el extremo N-terminal de los antídotos, formando así el dímero del antídoto una lámina β implicada en la represión por unión específica al ADN.

A continuación, se muestran algunos ejemplos de sistemas de proteínas antídoto contra venenos que se enumeran en la tabla al final del artículo:

- ccd

Este sistema, el mejor estudiado en la actualidad, se localiza en el plásmido F de Escherichia coli . Los dos genes del operón ccd codifican dos proteínas: el antídoto CcdA (72 aminoácidos) y el veneno ccdB (101 aminoácidos). Al aislar una ccd mutante resistente , se demostró que la diana de la ccd es la ADN girasa , una topoisomerasa tipo II que implica el manejo del superenrollamiento del ADN. Posteriormente, también se ha demostrado que ccdB envenena la girasa y provoca que cause roturas de doble hebra en el ADN de una manera dependiente de ATP.

El envenenamiento de la girasa por ccdB provoca la inducción del sistema SOS . Este sistema se activa durante cualquier evento que bloquee el avance de la bifurcación de replicación del ADN . Estos eventos pueden ser tan diversos como una ruptura del ADN, un dímero de timina o incluso un complejo proteico con el ADN. La inducción de SOS bloquea el proceso de división celular mientras se repara el daño. A medida que la célula continúa creciendo pero no se divide, parece filamentosa.

La autorrepresión del operón CCD requiere la presencia de CcdA ET ccdB . La forma involucrada en la unión al ADN es un tetrámero (CcdA) 2 - ( ccdB ) 2 , la forma libre como un hexámero (CcdA) 2 - ( ccdB ) 4 , lo que sugiere que la disminución relativa en la cantidad de CcdA disminuye la represión y por lo tanto promueve su síntesis. CcdA41, una deleción que comprende solo los 41 aminoácidos C-terminales de CcdA, pierde la capacidad de autorregulación mientras conserva sus propiedades anti-matanza. Esto sugiere fuertemente que la parte N-terminal de CcdA es responsable de unirse al promotor del operón ccd . Esta hipótesis está respaldada por el hecho de que una mutación puntual de arginina 4 a alanina en CcdA suprime la actividad represiva.

La proteína CcdA es degradada por la proteasa Lon a pesar de su afinidad por Lon, que es mucho menor que la de ccdB . Los modelos ofrecen las formas de degradación "accidentalmente" que la CcdA libre es suficiente para causar la muerte posterior a la segregación , o que hay un proceso activo que desestabiliza el complejo CcdA- ccd .

- pem

El operón pem del plásmido R100 ( E. coli ) codifica el antídoto PemI (84 aminoácidos) y el veneno PemK (110 aminoácidos). Este sistema es idéntico al sistema parD del plásmido R1, entonces el antídoto se llamaba Kis y el veneno Kid, pero usaremos el primer nombre para evitar cualquier confusión con el sistema parDE que se detalla a continuación.

Al igual que el ccd , la estabilización del plásmido se debe a la degradación del antídoto PemI por parte de Lon y la autorrepresión completa requiere tanto el veneno como el antídoto, aunque se observa una represión débil con el antídoto solo.

El objetivo del veneno PemK podría ser DnaB. DnaB es una helicasa involucrada en el inicio de la replicación del ADN y la sobreproducción de DnaB inhibe la acción tóxica de PemK). PemK actuaría como un inhibidor de la división celular aunque se haya observado un efecto de muerte posterior a la segregación en ciertas cepas.

- PARDE

RK2 (también llamado RP4) es un plásmido grande de 60 kb (1 kb = mil pares de bases de ADN). Su rango de hospedadores es muy amplio en bacterias Gram- negativas con hospedadores tan diversos que E. coli ( Enterobacteriaceae ), Agrobacterium tumefaciens (patógeno bacteriano de plantas) de rizobios ( simbiótico de legumbres ) o Pseudomonas aeruginosa ( humanos patógenos responsables en particular de infecciones nosocomiales ). Se encuentra allí en 4 a 8 copias por cromosoma dependiendo de la especie.

Un locus de 3,2 kb llamado par es responsable de estabilizar RK2. Contiene cinco genes organizados en dos operones divergentes. El primer operón, parCBA (2,3 kb), ya mencionado anteriormente, es responsable de un sistema de resolución de multímeros y el segundo, parDE (0,7 kb), es un sistema de muerte post-segregacional donde ParD es el antídoto (83 aminoácidos) y ParE , el veneno (103 aminoácidos). La combinación de estos dos sistemas permite una tasa de pérdida muy baja, pero la contribución relativa de los dos operones a la estabilización es variable según la cepa de E. coli y la temperatura de crecimiento.

Aún no se ha determinado el objetivo del veneno de ParE, pero como ccd , ParE provoca la muerte de las células que han perdido la inhibición de la replicación del plásmido, la inducción del sistema SOS y la aparición de bacterias filamentosas. Conociendo por un lado la diversidad de hospedadores en los que es funcional el sistema parDE de RK2 y, por otro lado, la dificultad para encontrar mutantes resistentes a ParE, se puede pensar razonablemente que ParE afecta a una función esencial y muy conservada en la evolución, y probablemente el sitio muy activo de su objetivo.

ParE está codificado por un gen que comienza una base cadena arriba del codón de terminación de parD . Sin embargo, si se desconocen las concentraciones in vivo de ParD y ParE, se puede estimar que la expresión de ParE es mucho menor que la de ParD, siendo parE el segundo gen del operón y comenzando, además, con un codón TTG . muy eficaz a diferencia de otros venenos, que comienzan con un codón ATG clásico.

La auto-represión es lograda por ParD o por el complejo ParD-ParE, sin ninguna detección de ParE en esta represión. Sin embargo, si ParD se encuentra en forma de dímero en solución, 4 moléculas de ParD se unen al promotor . ${\ Displaystyle P_ {parDE}}$

La estructura 3D de ParD es desconocida, pero las predicciones de la estructura secundaria convergen para decir que contiene una hebra β N-terminal seguida de 3 o 4 hélices α conectadas por bucles cortos. Estos resultados son consistentes con estudios de dicroísmo circular y espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Por tanto, ParD se uniría a la familia de proteínas de unión a ADN de hoja β.

De la misma manera que para CcdA y como para PemI, la proteasa de E. coli responsable de la inestabilidad relativa de ParD es Lon).

- mazEF y otros sistemas cromosómicos

El módulo mazEF (o chpA ) está ubicado en el operón rel aguas abajo del gen que codifica la proteína RelA. A diferencia de los anteriores, no se encuentra en un plásmido sino en el propio cromosoma de E. coli . Por lo tanto, no es un sistema de muerte post-segregacional porque, a diferencia de los plásmidos, el cromosoma no se "pierde" ... Su secuencia es parcialmente homóloga a la de pem así como a otro sistema cromosómico de E. coli , chpB . La expresión de mazEF (MazE, 82 aminoácidos, siendo el antídoto y MazF, 111 aminoácidos, el veneno) es inhibida por guanosina-3 ', 5'-bispirofosfato (ppGpp) sintetizado por RelA durante deficiencias extremas de aminoácidos. En este caso, MazE es degradado por la proteasa ClpPA, MazF es libre de envenenar su objetivo (desconocido), lo que conduce a la muerte celular. Se cree que esto permitiría la supervivencia de la población bacteriana sacrificando muchas de las células deficientes.

También se ha demostrado que este sistema de muerte programada podría ser inducido por antibióticos que inhiben la transcripción o traducción como la rifampicina , el cloranfenicol o la espectinomicina . También es activado por el sistema phd / doc que discutiremos poco después.

Se ha descubierto otro sistema cromosómico, relBE , en el genoma de E. coli K12 y es homólogo a varios plásmidos o sistemas cromosómicos de E. coli u otras especies bacterianas gramnegativas, así como a sistemas cromosómicos. incluso arqueas . Hasta la fecha, no se ha encontrado ningún homólogo en eucariotas pero se ha demostrado que RelE de E. coli también es activo en Saccharomyces cerevisiae y que RelB contrarresta su acción, al menos parcialmente, siendo el nivel de expresión de RelB relativamente bajo en el procedimiento. usó.

Los homólogos cromosómicos de ccd también se encuentran en la cepa patógena O157: H7 de E. coli , de hok / sok en E. coli o, alternativamente, de parDE en Mycobacterium tuberculosis , Vibrio cholerae o Yersinia enterocolitica .

- doctorado / doc

En su fase lisogénica, el bacteriófago P1 de E. coli está presente como un plásmido de bajo número de copias. Contiene el módulo phd / doc PSK donde Phd (73 aminoácidos) es el antídoto inestable y Doc (126 aminoácidos) el veneno estable. Phd es degradado por la proteasa ClpPX. Phd es capaz de autorregular el operón, pero es más eficiente en presencia de Doc.

El objetivo de Doc aún no se conoce, pero estaría involucrado en un paso esencial para la síntesis de proteínas. Se estableció que la presencia de mazEF era necesaria para la función de muerte posterior a la segregación de phd / doc , lo que sugiere que Doc provoca la inhibición de la traducción del antídoto MazE, lo que provoca la muerte. Por tanto, estos dos mecanismos se acoplarían en cascada.

- modificación-restricción

Otro tipo de sistema de antídoto de veneno es el sistema de modificación de restricción (RM). Normalmente, uno de los sistemas bacterianos para proteger contra ADN extraños ( por ejemplo, fagos ) es la presencia de enzimas de restricción que escinden la molécula de ADN en o cerca de un sitio específico. La protección del genoma de las bacterias se asegura modificando las enzimas que metilan la molécula de ADN, evitando así la acción de las enzimas de restricción.

Este sistema también funciona para la estabilización de plásmidos. La diferencia fundamental con los sistemas "clásicos" de antídoto de veneno es que las dos enzimas no forman un complejo que inactiva la enzima de restricción. Además, el efecto de muerte posterior a la segregación no se debe a una degradación más rápida de la metilasa, lo que permite la liberación del veneno. Por tanto, se ha propuesto un modelo en el que la dilución gradual de las dos enzimas durante las sucesivas divisiones conduciría a un punto en el que la metilación ya no es lo suficientemente eficaz, dejando que las pocas enzimas de restricción restantes causen un daño irreparable al ADN.

Tabla: Propiedades de los sistemas antídoto-veneno

Sistema	Localización	Antídoto , número de aminoácidos	Veneno , cantidad de aminoácidos	Objetivo de veneno	Proteasa degradando el antídoto
ccd	plásmido F	CcdA, 72	CcdB , 101	girasa	Lon
pem	Plásmidos R1 y R100	PemI (o Kis), 84	PemK (o niño), 110	DnaB? *	Lon
por	plásmido RK2 (o RP4)	ParD, 83	ParE, 103	no determinado	Lon
mazEF (o chpA )	Cromosoma de E. coli	MazE (o ChpAI), 82	MazF (o ChpAK), 111	no determinado	ClpAP
phd / doc	Plásmido P1	Doctorado, 73	Doc, 126	no determinado	ClpXP

*: no se obtuvo ningún mutante resistente a PemK pero la sobreproducción de DnaB inhibe la acción de PemK, lo que sugiere que DnaB es el objetivo de PemK.

Referencias

Hayes F. Toxinas-antitoxinas: mantenimiento de plásmidos, muerte celular programada y detención del ciclo celular. Ciencias. 12 de septiembre de 2003; 301 (5639): 1496-9
Van Melderen L. Interacciones moleculares del veneno CcdB con su objetivo bacteriano, la ADNgirasa. Int J Med Microbiol. Febrero de 2002; 291 (6-7): 537-44.
Bernard y col. Vectores de selección positiva utilizando el gen asesino ccdB del plásmido F. Malestar. 11 de octubre de 1994; 148 (1): 71-4.
(en) Lipps G (editor)., Plásmidos: Investigación actual y tendencias futuras , Norfolk, Caister Academic Press,2008, 263 p. ( ISBN 978-1-904455-35-6 , LCCN 2008411779 , leer en línea )