Una ribozima de cabeza de martillo ( ribozima de cabeza de martillo en inglés) es un segmento de ARN que cataliza la escisión y unión reversible de un sitio específico en una molécula de ARN. Estas ribozimas se utilizan como modelos para la investigación de estructuras y propiedades de ARN, así como en experimentos de escisión de ARN dirigida, algunos para aplicaciones terapéuticas. Reciben su nombre del parecido de las primeras representaciones de su estructura secundaria con el tiburón martillo . Primero se identificaron entre los ARN satélite y los viroides y luego se descubrió que estaban muy distribuidos en muchas formas de vida.
Las reacciones de autoescisión, publicadas por primera vez en 1986, son parte de un mecanismo de replicación circular . La secuencia de estas ribozimas es suficiente para la autoescisión y funciona formando una estructura terciaria tridimensional conservada.
Las primeras ribozimas de cabeza de martillo se descubrieron en 1986 en ciertos agentes infecciosos de plantas de ARN como los viroides y los satélites . Luego, se identificó otro al año siguiente en el ADN satélite de los genomas de tritón . Luego, se encontraron otros ejemplos de estas ribozimas en el genoma de diferentes organismos como los esquistosomas , los grillos de las cavernas , el cangrejo y algunos mamíferos como los roedores y el ornitorrinco . En 2010, quedó claro que la ribozima cabeza de martillo en realidad está muy extendida en el genoma de las bacterias hasta los eucariotas , incluidos los humanos . Publicaciones similares han confirmado y ampliado posteriormente estas observaciones, revelando la naturaleza ubicua de la ribozima cabeza de martillo en todos los reinos vivientes.
En los genomas eucariotas, muchas ribozimas de cabeza de martillo parecen estar relacionadas con los retrotransposones ( SINE ), a excepción de una familia sorprendentemente conservada que se encuentra en el genoma de todos los amniotas ; estos últimos, llamados HH9 y HH10, se encuentran en los intrones de unos pocos genes específicos y se refieren a una función biológica preservada durante la biosíntesis del ARN premensajero .
La secuencia mínima requerida para la auto-escisión de la reacción comprende aproximadamente 13 nucleótidos que forman un "núcleo" o "corazón", conservados, la mayoría de estas nucleobases no están implicadas en los pares de bases canónicos de tipo Watson Crick. Esta región está bordeada por tres regiones de tallo-bucle que consisten esencialmente en pares de bases canónicos del tipo Watson-Crick pero sin ninguna otra restricción desde el punto de vista de la secuencia. La constante catalítica mínima de la ribozima de cabeza de martillo es de aproximadamente 1 min −1 ; comúnmente se observa un rango de valores de 0,1 min −1 a 10 min −1 dependiendo de las secuencias no conservadas y la longitud de las tres barras helicoidales, en el condiciones estándar de reacción: concentración en Mg 2+ desde aproximadamente 10 mmol l -1 , pH 7,5 y teperature de 25 ° C . La mayor parte de la investigación sobre las ribozimas de cabeza de martillo se ha realizado sobre la ribozima mínima.
La ribozima cabeza de martillo está estructurada en tres hélices formadas por pares de bases, estas hélices están unidas entre sí por segmentos cortos con secuencias conservadas. Estas hélices se denominan I , II y III . Las ribozimas de cabeza de martillo se pueden clasificar en tres tipos según el número de hélice en la que se encuentran los extremos 5 'y 3' : el tipo I se encuentra en el genoma de procariotas , eucariotas y agentes infecciosos para el ARN de las plantas , mientras que el tipo II se ha descrito solo en procariotas y el tipo III se encuentra principalmente en plantas, agentes infecciosos de plantas y procariotas.
La ribozima de cabeza de martillo completa contiene secuencias adicionales en las varillas I y II que permiten la formación de contactos intramoleculares adicionales estabilizando la estructura terciaria activa de la molécula y permitiendo alcanzar tasas de escisión mil veces superiores a las de las secuencias mínimas.
La ribozima mínima de cabeza de martillo ha sido ampliamente estudiada por bioquímicos, así como por cristalografía de rayos X , espectroscopia de RMN y otras técnicas biofísicas de investigación . La première structure tridimensionnelle détaillée d'un ribozyme minimal a été obtenue en 1994 à partir d'une diffraction par rayons X d'un ribozyme en tête de marteau lié à un analogue ADN de substrat, une structure entièrement en ARN étant publiée l'année siguiente, próximo. Este último reveló tres hélices de ribonucleótidos emparejadas, llamadas I , II y III , separadas por secuencias cortas conservadas: el conector entre las hélices I y II generalmente contiene la secuencia C U G A mientras que el que se encuentra entre las hélices II y III contiene la secuencia G AAA ; el sitio activo de la reacción de escisión se encuentra entre las hélices I y III , en las que habitualmente se encuentra un residuo de citosina .
Sin embargo, esta estructura cristalizada obtenida por difracción de rayos X ha resultado difícil de conciliar con las limitaciones geométricas deducidas de los análisis por resonancia magnética nuclear y de los experimentos bioquímicos destinados a estudiar la cinética y el mecanismo catalítico de la ribozima. Por lo tanto, los residuos invariantes C3 , G5 , G8 y G12 de la ribozima mínima son críticos hasta el punto de que la más mínima sustitución de un grupo funcional exocíclico en uno de estos residuos conduce a una desaparición casi completa o incluso completa de toda la actividad catalítica, y esto, aunque no parecen formar un enlace de hidrógeno como parte de un par Watson-Crick en ninguna de las estructuras cristalinas de ribozima de cabeza de martillo mínimas, a excepción del residuo G5 . Se han destacado otras dificultades, por ejemplo el papel de los residuos G8 y G12 en la catálisis ácido / base de la ribozima que las estructuras cristalizadas no hacen evidente, o el efecto Overhauser nuclear observado por resonancia magnética nuclear entre ellos. Residuos U4 y U7 , que la estructura cristalina no puede explicar porque este efecto requiere una distancia máxima de 6 Å que es apenas compatible con la estructura obtenida por cristalografía de rayos X.
Estas dificultades, y algunas otras, que dificultan la conciliación de las estructuras obtenidas por cristalografía con las restricciones geométricas deducidas por otros enfoques, que afectan la estructura terciaria de las ribozimas de cabeza de martillo mínimas se han resuelto en gran medida con la estructura cristalizada de ribozimas completas. Este último muestra numerosas interacciones entre los bucles de las varillas I y II , incluso a una distancia del sitio activo .
La configuración tridimensional del sitio activo de la ribozima cabeza de martillo se estabiliza mediante numerosas interacciones intramoleculares de la ribozima completa, alineando el oxígeno 2 'del residuo C17 , que constituye el nucleófilo del sitio catalítico, casi perfectamente para la sustitución nucleofílica bimolecular ( S N 2). El residuo G12 está lo suficientemente cerca de este nucleófilo como para establecer un enlace de hidrógeno con él y permitir que se reste un protón del oxígeno 2 'si el residuo G12 está desprotonado. El hidroxilo 2 ' del residuo G8 establece un enlace de hidrógeno con el oxígeno del grupo 5' y, por tanto, es probable que proporcione un protón cuando se acumulan cargas negativas en el oxígeno 5 'de la ribosa del residuo A1.1.
Reemplazar el residuo G8 con un residuo C8 (mutación G 8 C ) elimina toda la actividad catalítica de la ribozima cabeza de martillo, mientras que una mutación doble C 3 G + G 8 C retiene la mayor parte; reemplazar el residuo G8 con un residuo desoxi G8 reduce muy significativamente la actividad catalítica, lo que sugiere que el hidroxilo 2 'de este residuo es de hecho crítico para su mecanismo de reacción.
La aproximación del residuo A9 y los fosfatos scissile (en) requiere una alta concentración de cargas positivas, lo que da como resultado la observación de que se requieren iones metálicos divalentes como Mg 2+ a una concentración iónica baja, pero se pueden dispersar con una mayor concentración de cationes monovalentes . Por tanto, la reacción probablemente implica la extracción del protón 2 'del residuo C17 y luego el ataque nucleofílico del fosfato adyacente. La ribosa del residuo G8 luego proporciona un protón en la ruptura del enlace entre el fósforo escindible y el oxígeno 5 'del grupo saliente y luego se vuelve a protonar a partir de una molécula de agua .
Mecanismo de reacción propuesto para el sitio activo de la ribozima de cabeza de martillo. Una base ( B ) elimina un protón del oxígeno 2 'mientras que un ácido ( A ) proporciona un protón al grupo saliente 5' dando como resultado un fosfato cíclico 2 ', 3'. Los enlaces rotos (en rojo) y formados (en línea de puntos) deben estar en una posición axial de aproximadamente 180 ° a cada lado. El movimiento de los electrones está representado por flechas.
Posibles interacciones del estado de transición extrapoladas de la estructura de la ribozima cristalizada.
Sitio activo de una ribozima de cabeza de martillo completa. El residuo G12 se coloca de acuerdo con su papel como base en la reacción de escisión, mientras que el hidroxilo 2 'del residuo G8 se coloca de acuerdo con su papel ácido para la catálisis ácido / base . Los enlaces de hidrógeno potencialmente "activos" están resaltados con puntos naranjas. El oxígeno 2 'del residuo C17 aparece alineado para el ataque nucleofílico a lo largo de la ruta que se muestra con una línea de puntos azul.