La microscopía de fluorescencia (o epifluorescencia ) es una técnica que utiliza un microscopio óptico aprovechando el fenómeno de fluorescencia y fosforescencia en lugar de, o además de la observación convencional por reflexión o absorción de luz visible natural o artificial.
Así podemos observar diversos objetos, sustancias (orgánicas o inorgánicas) o muestras de organismos vivos o muertos.
Ahora es parte de los métodos de investigación y biología clásicos y continúa desarrollándose con imágenes moleculares .
La fluorescencia es la propiedad que poseen ciertos cuerpos de emitir luz después de absorber fotones de mayor energía. La microscopía de fluorescencia se basa en la formación de una imagen mediante la detección de esta luz emitida. El desplazamiento de Stokes describe la diferencia entre la longitud de onda absorbida por la longitud del objeto (emitida por la fuente de luz del microscopio) y la emitida por el objeto. Cuanto mayor sea la diferencia entre las dos longitudes de onda, más fácil será observar la fluorescencia.
En fluorescencia se distinguen dos tipos de objetos:
En microscopía de fluorescencia, por lo tanto, es posible visualizar directamente sustancias fluorescentes. Para las sustancias, células, moléculas no fluorescentes, es necesario marcarlas con sustancias llamadas fluorocromos, como DAPI que marca el ADN y fluoresce en azul.
Ciertos marcadores genéticos como la proteína verde fluorescente (en inglés Green Fluorescent Protein o GFP) también se utilizan ampliamente en biología en organismos genéticamente modificados para producirlos de forma endógena . En este caso, el fluorocromo es una proteína producida directamente por la propia célula y no requiere la adición de sustrato. La fluorescencia se puede visualizar directamente en células vivas, este es uno de los campos desarrollados por imágenes moleculares .
Se pueden utilizar muchas técnicas de marcado:
Las sustancias fluorescentes pueden excitarse mediante excitación de un solo fotón. Para ello se utiliza una luz de excitación, cuya longitud de onda excita directamente al fluoróforo. Por tanto, la fluorescencia emitida puede provenir de todo el espesor de la muestra atravesada por el haz de excitación. El elemento clave de este microscopio confocal está representado por una "ventana" (un agujero de alfiler o un iris confocal) colocada frente al detector que elimina la fluorescencia de las regiones no focales. La observación de señales de fluorescencia se basa en cinco elementos:
Esta excitación consiste en la absorción casi simultánea de varios fotones de excitación de una longitud de onda cercana a un múltiplo de la excitación óptima en un fotón. Para ello, se utiliza un láser pulsado en frecuencias cercanas al infrarrojo. En este caso, solo el punto focal del rayo láser es un excitador (suficiente densidad de fotones para acoplar la energía de excitación). A menudo, las aplicaciones se limitan a la microscopía de dos fotones (excitación del fluoróforo por dos fotones).
Este sistema se considera un desarrollo tecnológico importante por tres razones principales:
En la práctica, la eficiencia de emisión de fluorescencia es menos buena que la de un solo fotón confocal y la relación señal / ruido es menor. Por tanto, muestra poca ventaja para la observación de células cultivadas o secciones de tejido (50-70 µm de espesor).
Esta técnica se utiliza naturalmente para la excitación simultánea de varios fluoróforos con diferentes espectros de emisión.
Una variante de esta técnica es la microscopía de fluorescencia por excitación multifotónica multifocal . El principio es idéntico, pero el rayo láser se divide en varios rayos, lo que permite escanear varios puntos simultáneamente. Esto permite reducir el tiempo de adquisición de las imágenes.
Las técnicas de fluorescencia se pueden utilizar con diferentes tipos de microscopio:
Estos dispositivos tienen piezas intercambiables en forma de cubo dispuestas en una torreta giratoria o en una lengüeta de tiro según el fabricante.
Estos “cubos” filtran la luz que va hacia el objetivo y va hacia el observador o el sensor, según las fluorescencias buscadas.
Incluyen 2 filtros y un espejo particular, "dicroico" que refleja determinadas longitudes de onda y que es atravesado por otras.
Hacia la fuente está el filtro de excitación.
En el lado del observador está el filtro de barrera.
Los cubos se enumeran según las luces de excitación: ultravioleta, violeta, azul, verde ...
Esta técnica se utiliza, en particular, para observar monocapas lipídicas a las que se ha añadido una sonda lipídica fluorescente. Se observa fluorescencia en función de la fase en la que se encuentre el lípido principal. En general, la sonda es soluble en la fase líquida expandida (LE) pero no en las fases gaseosa (G) o sólida (S). Esto permite observar las macroestructuras formadas por la monocapa. En el lado opuesto, se observa una monocapa de lípidos en equilibrio mediante microscopía de epifluorescencia . La sonda lipídica fluorescente es soluble en la fase LE pero no en la fase G. El resultado es que observamos, en equilibrio, tipos de burbujas (pero una "burbuja" es un concepto tridimensional) cuyas paredes están formadas. lípido en fase LE y el interior en fase G. Si tomamos un ejemplo tridimensional, sería como tomar espuma de jabón y cortar una rodaja muy fina de ella.
Imágenes de epifluorescencia de tres componentes de una célula cancerosa humana en división. El ADN aparece en azul, una proteína llamada INCENP aparece en verde y los microtúbulos en rojo. Se obtuvieron imágenes de cada fluoróforo por separado, con una longitud de onda de excitación específica y filtros, luego se recompuso una imagen, a partir de las fotos tomadas por la cámara CCD .
Células endoteliales de una arteria pulmonar bovina (núcleos teñidos de azul con DAPI, microtúbulos marcados en verde con un anticuerpo unido a FITC y filamentos de actina marcados en rojo con faloidina unida a la proteína TRITC).
Núcleo de linfocitos humanos teñido con DAPI con los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo) mediante sondas hibridadas con centrómeros ( hibridación in situ en fluorescencia ).
Membrana de células de levadura , demostración de estructura (en amarillo) obtenida por fusión de proteínas de membrana con dos marcadores fluorescentes (RFP y GFP).
Detección de la molécula YFP en una célula cancerosa humana, a escala nanométrica.
Núcleo de una célula de cáncer de hueso (técnica llamada microscopía de localización de dos colores o 2CLM para angloparlantes). Imagen obtenida por fluorescencia de marcadores fusionados con las proteínas GFP y RFP, para 120.000 moléculas ubicadas en un área restringida (470 µm 2 ).