La inmunofluorescencia es una técnica de inmunotinción , que utiliza tanto anticuerpos como fluorocromos . La inmunofluorescencia permite revelar una proteína específica directamente en la célula, por emisión de fluorescencia . Por tanto, permite determinar no solo la presencia o ausencia de una proteína, sino también su ubicación en la célula o tejido analizado.
El fenómeno de fluorescencia fue descubierto en el medio del XIX ° siglo por los científico Inglés Sir George Gabriel Stokes . Fue el primero en observar que la fluorita , un mineral , presenta fluorescencia cuando se expone a los rayos ultravioleta , y le dio el nombre de "fluorescencia".
El primer trabajo con inmunofluorescencia se remonta a la década de 1950, cuando los anticuerpos se conjugaron con fluorocromos de naturaleza química, como la fluoresceína .
Las primeras proteínas fluorescentes (similares a los fluorocromos utilizados en inmunofluorescencia) fueron descubiertas mucho más tarde, con GFP ( Green Fluorescent Protein ), en la década de 1960, por Osamu Shimomura y Roger Y. Tsien . Derivado de una medusa ( Aequorea victoria ), el descubrimiento de esta proteína les valió el Premio Nobel de Química en 2008. Hoy en día, muchos fluorocromos utilizados en inmunofluorescencia son derivados de GFP.
Hay dos tipos de fluorescencia. En primer lugar, la denominada fluorescencia "natural", o autofluorescencia, emitida espontáneamente por la célula. Se puede citar, por ejemplo, la clorofila de las células vegetales. Luego está la fluorescencia conferida por un fluorocromo, una sustancia química que emite luz si se excita a una determinada longitud de onda.
En inmunofluorescencia se pueden realizar dos tipos de marcaje. La primera es la inmunofluorescencia directa. Durante este marcaje, se usa un anticuerpo dirigido contra la molécula deseada, llamado antígeno. Este anticuerpo está acoplado a un fluorocromo. Luego, para revelar la preparación, se puede usar un microscopio de epifluorescencia o un microscopio confocal. Esta técnica sigue siendo una de las más utilizadas en la investigación científica.
La inmunofluorescencia indirecta (IFI) se basa en el uso sucesivo de 2 anticuerpos: el primer anticuerpo de tipo monoclonal reconoce específicamente la proteína de interés. El segundo anticuerpo de tipo policlonal está dirigido contra el anticuerpo primario (el primero).
Esta es la segunda marca. En este caso, tenemos dos anticuerpos. El anticuerpo primario se dirige contra el antígeno deseado. Luego se usa un segundo anticuerpo, marcado con un fluorocromo, y que tiene una alta afinidad por el anticuerpo primario (dirigido contra el isotipo del anticuerpo primario, entonces es una antiglobulina ).
Como ventajas, existe la posibilidad de realizar múltiples marcados sobre una misma muestra de células, la rapidez y facilidad de uso de este método y también su buena fiabilidad. Además, en la inmunofluorescencia indirecta, hay un aumento en la intensidad de la luz, porque hay varios sitios de unión en los anticuerpos primarios, lo que hace posible tener varios anticuerpos secundarios unidos a ellos.
Pero existen algunos inconvenientes. Por ejemplo, la posibilidad de reacciones falsas positivas o falsas negativas, la apreciación subjetiva del grado de fluorescencia y el fenómeno de fotoblanqueo. Para superar estos inconvenientes, existen varias técnicas. En primer lugar, realizar un control negativo por inmunofluorescencia indirecta, es decir poner en contacto únicamente los anticuerpos secundarios (marcados) con la muestra a analizar. Después de un paso de lavado, si el control negativo es bueno, no debería haber emitido fluorescencia, porque los anticuerpos secundarios no pudieron unirse y por lo tanto se fueron después del paso de lavado. Luego, el uso de cámara de alta resolución y alta sensibilidad atenúa el fotoblanqueo y permite un estudio cuantitativo de la adquisición.
Aunque el principio de inmunofluorescencia es simple, en la práctica deben tenerse en cuenta muchos factores.
Podemos distinguir tres áreas:
La inmunofluorescencia se utiliza en células en cultivo (luego hablaremos de inmunocitoquímica ) o en secciones de tejidos ( inmunohistoquímica ).