Un chip de ADN es una colección de moléculas de ADN unidas en filas ordenadas sobre una pequeña superficie que puede ser de vidrio , silicona o plástico . Esta reciente biotecnología permite analizar el nivel de expresión de genes ( transcripciones ) en una célula , un tejido, un órgano, un organismo o incluso una mezcla compleja, en un momento dado y en un estado dado en relación a una muestra de .referencia.
Los chips de ADN también se denominan chips de genes , biochips o por los términos en inglés “ DNA chip, DNA-microarray, biochip ” . Los términos franceses DNA microarray y DNA microarray también son términos propuestos por la Office québécois de la langue française .
El principio del chip de ADN se basa en la propiedad del ADN desnaturalizado (hebra única) de reformar espontáneamente su doble hélice cuando está en presencia de una hebra complementaria ( reacción de hibridación ). Las cuatro bases nucleicas del ADN ( A , G , C , T ) tienen de hecho la particularidad de emparejarse de dos en dos por enlaces de hidrógeno (A = T y T = A; G ≡ C y C ≡ G).
Hablamos de sonda (fragmento de ADN sintético representativo de los genes cuya expresión queremos estudiar, unido covalentemente a la superficie del biochip) y diana (ARNm que queremos identificar y / o cuantificar (muestra)). Los objetivos están etiquetados con fluorescencia (ver más abajo).
Las micromatrices se pueden utilizar para medir / detectar ARN que se traducirán o no en proteínas. Los científicos hablan de análisis de expresión o perfil de expresión . Dado que es posible unir hasta un millón de sondas en un biochip, los microarrays de ADN constituyen un enfoque masivo y han contribuido a la revolución de la genómica , ya que permiten en un solo experimento tener una estimación sobre la expresión de varias decenas de miles de genes. Pero también hay una gran cantidad de aplicaciones diferentes que involucran la tecnología de chips de ADN (detección de mutaciones, resecuenciación, interacciones ADN / proteína, ecología microbiana).
En la práctica, los ARN totales se extraen de las células estudiadas y en ocasiones se amplifican, lo que permitirá obtener una cantidad suficiente de material genético para el experimento. A continuación, estos ARNm se transforman en ADN complementarios (ADNc) mediante la técnica de transcripción inversa y se marcan. Este marcaje ahora lo proporciona una molécula fluorescente ( fluorocromo ). Hay dos fluorocromos predominantemente utilizados: Cyanine 3 (Cy3) que presenta fluorescencia en verde y Cyanine 5 (Cy5) que presenta fluorescencia en rojo. Los objetivos así marcados (ADNc) se ponen en contacto con el chip (que lleva todas las sondas en su superficie), este paso se denomina hibridación. Cada hebra de ADNc se hibridará entonces con las sondas que son complementarias para formar un dúplex sonda / diana de doble hebra. A continuación, se lava el biochip en baños específicos para eliminar las hebras de ADNc que no se han hibridado porque no son complementarias a las sondas fijadas en el portaobjetos. Luego, el biochip será analizado por un escáner de muy alta resolución, a la longitud de onda de excitación de Cyanine 3 o Cyanine 5. La imagen escaneada es luego analizada por computadora para asociar un valor d intensidad en cada sonda unida al biochip y así determinar si ha habido hibridación para cada sonda.
Durante un experimento de biochip de ADN con el objetivo de comparar la expresión de genes entre dos condiciones (por ejemplo: célula sana versus célula enferma), se extraen los ARN totales de las dos poblaciones de células y cada una se marca con un fluorocromo diferente. Luego, las dos muestras se depositan simultáneamente en el biochip, esto se denomina hibridación competitiva. Para un gen dado, si el número de moléculas de ADNc correspondientes a este gen es mayor en una condición que en la otra, se favorecerá la hibridación entre estos ADNc y las sondas asociadas. Así, después de haber escaneado el biochip en las dos longitudes de los dos fluorocromos utilizados, es posible comparar la intensidad de la señal verde con la señal roja y así saber para cada gen estudiado bajo qué condición se expresa más.
Los inicios de los microarrays de ADN comenzaron en 1991 con una publicación de Stephen Fodor (científico estadounidense y fundador de la compañía Affymetrix ) sobre tecnología de síntesis in situ . Luego siguen varios eventos que entran en juego:
Hay dos tipos de análisis de biochips:
Uno de los puntos fuertes del biochip monocanal es que una muestra aberrante no afecta el análisis de otras muestras. Por el contrario, en los biochips de dos canales, una sola muestra de mala calidad es suficiente para reducir drásticamente la calidad de los resultados, incluso si la otra muestra objetivo es perfecta. Otro punto fuerte es que los datos de un biochip de un solo canal se comparan más fácilmente con otros biochips de diferentes experimentos. Además, el biochip monocanal es a veces la única solución posible para determinadas aplicaciones.
La siguiente tabla está tomada de la página de Wikipedia en inglés .
Nombre del proceso o tecnología | Descripción |
---|---|
La expresion genica | Este es el uso más conocido del chip de ADN. La expresión de genes se compara entre diferentes condiciones dadas o en el tiempo. Mediante la hibridación y el posterior análisis de imágenes, este proceso identifica qué genes están sobreexpresados o subexpresados en una condición determinada. Una vez que se han identificado estos genes, son necesarios más análisis in silico, como análisis de agrupamiento para agrupar genes con el mismo perfil de expresión. Por último, los resultados a menudo se confirmarán gen por gen mediante métodos como la PCR cuantitativa o Northern Blot. (métodos de análisis de genes) |
Inmunoprecipitación de cromatina | Los biochips también pueden utilizar el fenómeno de inmunoprecipitación de cromatina (inmunoprecipitación de cromatina en chip o ChIP-On-Chip ). Este método permite determinar la ubicación del sitio de unión a proteínas en el genoma. |
Polimorfismo | El chip de ADN también puede permitir detectar polimorfismos, es decir identificar polimorfismos puntuales de alelos dentro de una población o entre poblaciones, predecir el desarrollo de enfermedades dentro de una población, evaluar mutaciones o analizar los vínculos entre genes. |
Embaldosado | Estos chips están dedicados a la búsqueda de nuevas transcripciones (se entiende que significa el término "gen transcrito"). Es decir, cada segmento del cromosoma (no solo los genes conocidos) está dirigido por una sonda. Uno de los intereses es descubrir un gran número de ARN no codificantes (como los ARN largos no codificantes, por ejemplo). Por lo tanto, es posible mapear con éxito las transcripciones, buscar exones o incluso buscar factores de transcripción . |
Biochip de genes quiméricos | También hay biochips con un gen quimérico (o gen de fusión). El principio subyacente es el del empalme alternativo en inglés o el empalme alternativo en francés. Este biochip puede entonces detectar genes transcritos por fusión, por lo tanto a partir de muestras de cáncer. |
Hibridación genómica comparativa | Un chip de hibridación genómica comparativa es un chip de ADN que se utiliza para analizar cambios en el número de copias en el ADN. Esta técnica se utiliza principalmente para diagnosticar cánceres y enfermedades genéticas. |
GeneID | Estos chips de ADN se utilizan para detectar ciertos tipos de organismos en los alimentos (como los OGM ), micoplasmas en cultivos celulares o ciertos agentes infecciosos para diagnosticar enfermedades. La técnica se basa principalmente en la reacción en cadena de la polimerasa . |
La siguiente lista no pretende ser exhaustiva, pero ofrece una descripción general de los campos de aplicación de los biochips.
El chip es un portaobjetos, generalmente de vidrio, de tamaño aproximadamente pequeño (6 cm x 3 cm ), en el que se unen sondas complementarias a un fragmento de ácido nucleico diana (ADN o ARN). Se pueden conectar hasta un millón de sondas a un chip, lo que permite el análisis de varias decenas o incluso cientos de miles de genes.
¿Qué tipo de sonda poner en el chip?
Oligonucleótidos | Sondas largas | |
---|---|---|
Tamaño | 15 - 70 mares | > 100 mares |
Ventajas | - Detección de SNP (polimorfismo)
- Entregado "listo para detectar" |
- Insensible a alelos / variantes
- Producción de grandes cantidades - Colecciones disponibles (EST, BAC ...) - Doble hebra, más opciones de etiquetado, mejor cobertura del genoma |
Desventajas | - Sensible a alelos / variantes
- Costo de producción en masa - El diseño de los oligos es un paso complejo |
- menor resolución
- La producción de productos de PCR es pesada - Problema de hibridación cruzada - Errores de colección (EST) |
¿Qué tipos de genes están involucrados?
En sí mismo, no existe ninguna contraindicación con respecto al tipo de genes que se van a probar (genes con funciones conocidas o desconocidas). Sin embargo, para poder derivar información confiable de los experimentos con biochip, es recomendable incluir sondas de control positivo y negativo para verificar y controlar el correcto avance de cada paso del experimento.
Este método utiliza sondas largas (alrededor de cien nucleótidos) depositadas en el portaobjetos. Las sondas se sintetizan antes de depositarse en la superficie en filas de pequeñas gotas o manchas (de ahí el término en inglés microarray , “microtableau”). Utilizamos agujas finas controladas por un brazo robótico que se sumerge en las manchas. Luego, las agujas inyectarán el exceso de sondas en cada lugar. La "cuadrícula" final representa los perfiles de ácido nucleico de las sondas preparadas y cada sonda está lista para hibridar con las dianas.
Este método es el más simple, lo que hace que esta solución sea más accesible para los laboratorios académicos . Es utilizado por científicos e investigadores de todo el mundo para producir los chips adecuados para sus necesidades. Los chips se personalizan fácilmente para cada experimento porque los investigadores pueden elegir el tipo y la ubicación de las sondas, o incluso sintetizar las sondas ellos mismos.
Luego, los científicos pueden generar sus propias muestras objetivo, que se utilizan para la hibridación con las sondas, para finalmente analizar los chips con su propio equipo. Esto proporciona un chip que es más económico (evitando el costo de comprar chips comerciales) y también se adapta a sus requisitos.
Sin embargo, los chips que se fabrican de esta manera no pueden tener la misma densidad de sondas que los chips fabricados mediante síntesis in situ .
Estos chips se fabrican sintetizando pequeñas sondas de ADN (<80-mer) directamente sobre el soporte (biochip) mediante síntesis química.
Se obtiene una imagen de alta resolución utilizando escáneres de muy alta resolución (del orden de un micrómetro) que revelan las interacciones sonda / objetivo mediante la excitación de los fluorocromos transportados por los objetivos. En Francia, la empresa INNOPSYS desarrolla, fabrica y comercializa una gama completa de escáneres de fluorescencia dedicados a la lectura y análisis de este tipo de diapositivas: InnoScan 710 (2 colores, 3 µm / píxel, InnoScan 710-IR, InnoScan 910 (2 colores , 1 µm / píxel) e InnoScan 1100 (3 colores, 0,5 µm / píxel).
El software interpreta la intensidad de los píxeles en la imagen para deducir una medida digital de la expresión de cada gen.
El análisis de un chip de ADN genera grandes volúmenes de datos y se utilizan muchas técnicas para interpretar los resultados del experimento. Estas técnicas incluyen: