Las meganucleasas son endodésoxirribonucleasas ( nucleasas de ADN ) que se caracterizan por un gran sitio de reconocimiento (secuencias de ADN bicatenario de 12 a 40 pares de bases), por lo que generalmente está presente en una sola copia en un genoma dado. Para tomar un orden de magnitud, se necesitan 20 veces el tamaño del genoma humano para esperar encontrar 1 vez la secuencia de 18 pares de bases reconocida por la meganucleasa I-SceI. Por tanto, se considera que las meganucleasas son las enzimas de restricción más específicas.
Entre las meganucleasas, las endonucleasas homing de la familia LAGLIDADG se han convertido en los últimos quince años en herramientas privilegiadas para el estudio y para la ingeniería de genomas , que abarca las estrategias y técnicas desarrolladas recientemente para modificar de forma dirigida y genética específica. información - o genoma - de organismos vivos.
Las meganucleasas son "tijeras moleculares de ADN" que se pueden utilizar para reemplazar, eliminar o modificar secuencias de formas muy específicas. Al modificar su sitio de reconocimiento diseñado por proteínas , se puede modificar la secuencia diana. Las meganucleasas se utilizan para modificar todo tipo de genomas - bacterianos, vegetales, animales - y abren amplias posibilidades de innovación, especialmente en salud humana (eliminación de material genético viral o "reparación" de genes alterados) y en agricultura biotecnológica.
Las meganucleasas se encuentran en una gran cantidad de organismos: arqueas (arqueas), bacterias, fagos , hongos, levaduras, algas, ciertas plantas. Pueden expresarse en diferentes compartimentos de la célula: núcleo, mitocondrias , cloroplastos . Se han identificado varios cientos de estas enzimas .
Las meganucleasas están representadas principalmente por dos grandes familias de enzimas agrupadas bajo el término endonucleasas autodirigidas: endonucleasas intrónicas e inteínas. En la naturaleza, estas proteínas están codificadas por elementos genéticos móviles, intrones o inteínas . Los intrones se propagan integrándose en un lugar preciso del ADN y provocando, gracias a la meganucleasa expresada, la rotura del alelo complementario que no contiene el elemento móvil. En el caso de los intrones e inteínas del grupo I, la ruptura induce la duplicación del elemento móvil a nivel del sitio de corte gracias a la intervención del mecanismo de recombinación homóloga del ADN bicatenario.
No se conoce bien la función precisa de las meganucleasas. La hipótesis más extendida es que el material genético que los codifica funciona como un elemento parásito utilizando los mecanismos celulares de reparación del ADN bicatenario en su beneficio, para multiplicarse y transmitirse, sin alterar el material genético de su hospedador.
Hay cinco familias o clases de endonucleasas autodirigidas.
La más representada y conocida es la familia LAGLIDADG. Se encuentra principalmente en las mitocondrias y cloroplastos de organismos unicelulares eucariotas. Su nombre corresponde a una cadena de aminoácidos que se pueden encontrar, de forma más o menos conservada, en todas las proteínas de esta familia. Estas pequeñas proteínas también tienen la particularidad de tener estructuras tridimensionales compactas muy próximas entre sí.
Entre los mejores endonucleasas caracterizados y el más utilizado en la ingeniería de la investigación y el genoma, podemos citar I-SceI (descubrí en las mitocondrias del panadero 's levadura Saccharomyces cerevisiae ), I-CreI (de los cloroplastos de algas verdes Chlamydomonas reinhardtii ) y I-DmoI (de la archaeobacterium Desulfurococcus mobilis ).
Las endonucleasas LAGLIDADG más conocidas son homodímeros (por ejemplo I-CreI, compuesto por la asociación de dos copias del mismo dominio proteico) o bien monómeros que presentan simetría interna (I-SceI). El sitio de unión al ADN, que contiene el dominio catalítico, consta de dos partes distribuidas a cada lado del punto de corte. Los medios sitios de unión pueden ser extremadamente similares y unirse a una secuencia de ADN cuasipalindrómica (I-Crel) o ser diferentes (I-SceI).
Debido a su alta especificidad, que les da una alta precisión y una toxicidad celular mucho menor que otras enzimas de restricción, las meganucleasas se identificaron ya en la década de 1990 como herramientas de modificación del genoma particularmente prometedoras.
Sin embargo, la realización de recombinaciones genéticas inducidas por meganucleasas estaba limitada por el repertorio disponible. De hecho, incluso si existen cientos de meganucleasas en la naturaleza, e incluso si cada una de ellas tolera pequeñas variaciones de su sitio de reconocimiento, la probabilidad de encontrar una meganucleasa capaz de cortar un gen determinado en la ubicación deseada es extremadamente baja. Por lo tanto, la ingeniería de nuevas meganucleasas provistas del sitio de reconocimiento deseado se convirtió rápidamente en el objetivo de varios laboratorios de investigación. Las investigaciones y aplicaciones más extensas se relacionan con endonucleasas autodirigidas de la familia LAGLIDADG.
Para crear meganucleasas "hechas a medida", se han implementado dos tipos principales de enfoques:
Estos dos enfoques se pueden combinar para aumentar las posibilidades de crear nuevas enzimas, manteniendo una alta eficiencia y especificidad. Los científicos de Cellectis, una empresa francesa de biotecnología, han desarrollado así una colección de más de 20.000 dominios de proteínas derivados de la meganucleasa I-CreI homodimérica y otras estructuras de meganucleasa. Se pueden combinar en heterodímeros quiméricos funcionales hechos a medida para laboratorios de investigación o para actores industriales. Se creó así un gran banco que comprendía varias decenas de miles de unidades de proteínas. Se pueden combinar para obtener meganucleasas quiméricas que reconozcan el sitio objetivo, y así tener herramientas de investigación y desarrollo que puedan cubrir una amplia variedad de necesidades (investigación básica, salud, agricultura, industria, energía, etc.).
Esta técnica ha permitido, en particular, desarrollar numerosas meganucleasas específicas para secuencias genéticas de virus, plantas, etc. y producir a escala industrial dos meganucleasas capaces de escindir el gen XPC humano, cuya mutación está implicada en Xeroderma pigmentosum , una enfermedad monogénica grave que predispone al cáncer de piel y quemaduras cuando la piel está expuesta a los rayos ultravioleta.
Otro enfoque consiste en intentar predecir con la mayor precisión posible, utilizando modelos informáticos, la actividad de las meganucleasas modificadas y la especificidad de la secuencia de ácido nucleico reconocida. El " Northwest Genome Engineering Consortium " , un consorcio estadounidense financiado por los Institutos Nacionales de Salud , se ha embarcado en este camino con el objetivo de tratar la leucemia mediante la intervención en células madre hematopoyéticas . La predicción del modelo se verifica y se guía mediante la realización de mutagénesis dirigida al sitio y análisis bioquímico in vitro .
Video explicativo sobre meganucleasas producido por Cellectis