La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) o reacción en cadena de la polimerasa , generalmente siglé PCR (del inglés : reacción en cadena de la polimerasa ) o prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAT French Canada) es un método biológico de amplificación genética molecular in vitro .
Permite duplicar en grandes números (con un factor de multiplicación del orden de mil millones) una secuencia conocida de ADN o ARN , a partir de una pequeña cantidad (del orden de unos pocos picogramos) de ácido nucleótido (secuencia específica de ADN ( el amplicón )) y cebadores específicos que consisten en oligonucleótidos sintéticos de veinte a veinticinco nucleótidos. Podemos por lo tanto, por ejemplo, detectar la presencia de VIH o medir una carga viral (concentración del virus en el plasma), los rastros de OMG (organismos modificados genéticamente), o de la hepatitis B, virus C y D.
Utilizan cada vez más en medicina forense , esta técnica se basa en una combinación de dos factores:
Estos elementos permiten controlar la actividad enzimática gracias a las transiciones de temperatura (proporcionadas por un termociclador ) repetidas cíclicamente (cf. reacción en cadena ).
Las primeras ADN polimerasas utilizadas procedían de una bacteria termófila (resistente a temperaturas muy altas), por ejemplo Thermus aquaticus ( polimerasa Taq ) o incluso Pyrococcus furiosus (polimerasa Pfu), Thermococcus litoralis (polimerasa Vent o Tli), Thermus thermophilus (polimerasa Tth) . Hoy en día se dice que las enzimas utilizadas son recombinantes , lo que simplifica considerablemente su producción, y sus propiedades se han modificado ampliamente para hacerlas más eficientes y fieles.
En menos de diez años, hemos aprendido a hacer más de mil millones de copias en menos de una hora, lo que impuso la PCR en los laboratorios al revolucionar la biología molecular. Sin embargo, no es confiable para algunas fuentes de muestras ( orina , esputo ), posiblemente debido a los inhibidores de la polimerasa Taq .
La PCR es una tecnología que ha revolucionado la biología molecular y se ha establecido muy rápidamente en los laboratorios. Por el contrario, la PCR en tiempo real tuvo que esperar a que llegaran al mercado una serie de innovaciones tecnológicas antes de desarrollarse y todavía se considera una nueva metodología. El número de artículos por año que responden a las palabras clave " reacción en cadena de la polimerasa " (1) y " reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real " (2) en el motor de búsqueda PubMed da una idea bastante clara de su importancia en el mundo científico. Tenga en cuenta que el método no está libre de sesgos, por ejemplo, algunos artículos se encuentran para PCR en tiempo real en 1991 y 1992 (línea de puntos) mientras que su principio solo se describió en 1993. La diferencia (1-2) es representativa del peso de la PCR de punto final , que probablemente dará paso gradualmente al tiempo real.
Esta técnica ha evolucionado mucho desde sus inicios. Entre los cambios más fundamentales, encontramos:
En aras de la claridad, las fechas corresponden a la primera publicación en el campo y solo se citan los primeros autores, estando las referencias completas en el capítulo “Bibliografía”. Esta elección también permite limitar controversias como el papel de Rosalind Elsie Franklin en el descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ADN.
La PCR es una técnica basada en la repetición de ciclos de transición de temperatura. A excepción de ciertas metodologías (por ejemplo, el uso de sondas de hidrólisis), cada ciclo contiene tres pasos que se detallan a continuación. En aras del didacticismo, consideraremos para el siguiente ejemplo una eficiencia de PCR del 100%.
Este paso generalmente se realiza a temperatura ambiente. El ADN de doble hebra adopta su conformación de doble hélice. En este ejemplo, consideraremos que solo hay una molécula de ADN bicatenario inicial en la solución, el área coloreada (rosa y naranja) correspondiente a nuestro amplicón. Nota: Los ADN complementarios resultantes de la transcripción inversa son generalmente de una sola hebra y luego adoptarán conformaciones tridimensionales complejas similares a las de los ARN.
Desnaturalización inicial (1 'en el diagrama)Antes de iniciar los ciclos de PCR reales, se lleva a cabo un paso de calentamiento (generalmente de 10 a 15 minutos a 95 ° C ). Este paso permite: deshibridar los ADN bicatenarios, romper las estructuras secundarias, homogeneizar el medio de reacción por agitación térmica, activar las polimerasas tipo “Hot start”, desnaturalizar otras enzimas que pudieran estar en la solución ( Transcriptasa inversa, uracil-N-glicosilasa).
Fase de desnaturalización (1 en el diagrama)Este paso (generalmente de 0 a 1 minuto a 95 ° C. ) hace que sea posible dehybridize los ADN, a “de desasociación de” las polimerasas que todavía se una a una matriz y para homogeneizar el medio de reacción.
Fase de hibridación o emparejamiento de los cebadores (2 en el diagrama)Este paso (generalmente de 2 a 60 segundos a 56 - 64 ° C ) permite que los cebadores de sentido y antisentido se hibriden con los ADN molde gracias a una temperatura que les es termodinámicamente favorable. Pocas de las hebras de ADN molde pueden hibridar (unirse) con su hebra complementaria, lo que evitaría la unión del cebador, ya que los cebadores son mucho más cortos y están en una concentración mucho más alta. Experimentalmente, se observa que la PCR funciona incluso con una fase de hibridación con una temperatura unos grados superior a la Tm teórica de los cebadores, probablemente porque ya interactúan con las polimerasas, lo que estabilizaría su hibridación al ADN molde.
Características de los cebadoresEste paso (generalmente 4 a 120 segundos a 72 ° C ) permite que las polimerasas para sintetizar la cadena complementaria de su ADN molde a una temperatura que es óptima para ellos. Esta hebra está hecha de dNTP libres presentes en el medio de reacción. La duración de este paso depende normalmente de la longitud del amplicón.
Al final del paso 3, tenemos dos cadenas de ADN molde y dos cadenas (una con sentido y una antisentido) de ADN definidas con precisión solo en su extremo 5 '.
Ciclo n o 2Las tres fases proceden de la misma forma que en el ciclo n o 1, excepto que dos polimerasas que han alcanzado el final de su ADN molde se desprenden espontáneamente. Al final de la fase 3, obtenemos todos los tipos de ADN que existirán durante la PCR, a saber:
Lo mismo ocurre con el ciclo 2. Al final de la fase 3, observamos 1 hebra de tipo A y F, 3 de B y D, y 4 de C y E. Observamos la aparición de dos moléculas de ADN bicatenario de CE. a nuestro amplicón.
Ciclo n o 4Lo mismo ocurre con el ciclo 3. Al final de la fase 4, observamos 1 hebra de tipo A y F, 4 de B y D, y 11 de C y E. Observamos que el amplicón se convierte en la combinación mayoritaria.
Ciclos n o 5 y posterioresSi hubiéramos aumentado el número de ciclos, habríamos obtenido la siguiente tabla:
ciclos | ||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | no | ||
tipo de moléculas | PARA | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
B | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
VS | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
D | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
mi | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
F | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
unico filamento | número | 2 | 4 | 8 | dieciséis | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | 65536 | A n a F n |
% amplicón | 0,00 | 0,00 | 25.00 | 50,00 | 68,75 | 81.25 | 89.06 | 93,75 | 96,48 | 98.05 | 98,93 | 99,41 | 99,68 | 99,83 | 99,91 | 99,95 | ||
doble cadena | número | 1 | 2 | 4 | 8 | dieciséis | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | |
% amplicón | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 12,50 | 43,75 | 65,63 | 79,69 | 88,28 | 93,36 | 96,29 | 97,95 | 98,88 | 99,39 | 99,67 | 99,82 | 99,91 |
donde A n (B n , etc.) es el número de moléculas de tipo A (B, etc.) presentes después del n- ésimo ciclo.
Al analizar esta tabla, encontramos que:
Estos valores se obtuvieron a partir de una única molécula inicial de ADN de doble hebra, pero de lo contrario cada plantilla habría pasado por el mismo proceso. En un ciclo dado, la cantidad de ADN depende, por tanto, del número inicial de matrices. Por otro lado, sea cual sea su concentración inicial, teóricamente es posible obtener cualquier cantidad ajustando el número de ciclos. Por lo tanto, PCR se rige teóricamente por la ley:
Pero la PCR es una reacción enzimática compleja. El producto es idéntico al sustrato y puede llegar a inhibir la enzima, pero sobre todo, pueden empezar a faltar los reactivos secundarios (cebadores, dNTP). Por lo tanto, la PCR solo puede tener una ley de amplificación exponencial siempre que el ADN molde sea el único factor limitante . Entonces, la reacción se vuelve impredecible y es imposible poder comparar varias muestras entre sí sin un sesgo cuantitativo más o menos significativo (ver el artículo sobre PCR cuantitativa ). Por tanto, es importante comprender las diferentes fases de la cinética de la PCR.
Este capítulo trata de la cinética medible de un PCR, porque las limitaciones tecnológicas hacen inaccesibles los primeros ciclos y, en general, una gran parte de la parte exponencial. Su perfil aparente (medible) adopta varias fases distintas, más o menos desarrolladas según opciones metodológicas.
NB : El término eficacia puede tener dos significados según los autores:
Las conclusiones extraídas de estos dos conceptos (que pueden deducirse directamente el uno del otro) son absolutamente idénticas; para la siguiente discusión, retendremos la primera definición, mayoría. Esta eficiencia de la PCR es un elemento fundamental a tener en cuenta a la hora de obtener una medición cuantitativa o establecer un protocolo de PCR multiplex, pero generalmente es insignificante para un resultado de PCR cualitativo o de punto final .
En el caso de un ciclo teórico perfecto, cada hebra de plantilla da una y solo una copia completa del amplicón. Por tanto, el número total de hebras se duplica en cada paso, y la eficacia teórica de una reacción de PCR (indicada con E ) es, en este caso, exactamente igual a dos. En el gráfico que da el resultado en un punto de referencia semilogarítmico , esto da como resultado el hecho de que la pendiente de la parte rectilínea corresponde a una progresión ideal de log (2) por ciclo (es decir, aproximadamente 3 decibelios por ciclo).
La llegada de la PCR en tiempo real puso de relieve que la eficacia real de la reacción no siempre era igual a dos. Esto significa que en todos los ciclos considerados cuantitativa (área n o 6 cinética) en las condiciones reales de replicación, una hebra pueden no dar una copia y una individual. En la gráfica de referencia semilogarítmica, esto da como resultado una pendiente del lado derecho que es diferente de la pendiente esperada, y generalmente menos empinada. La pendiente experimental es medible, y le da el valor experimental de E . El hecho de que esta parte sea recta significa que en este intervalo de concentración, el número medio de copias producidas por una hebra es constante de un ciclo a otro (y en particular, no depende de las concentraciones). Pero no hay, en este caso, "una copia y solo una por hebra", sino un número diferente.
La mayoría de los protocolos experimentales dan una eficiencia de PCR entre 1,75 y 2. Dos fenómenos son las causas principales, y conducen a una eficiencia experimental menor o igual a dos, debido a que las reacciones bioquímicas no siempre son totales, algunas replicaciones fallan bajo condiciones experimentales reales. condiciones:
Por el contrario, algunas fuentes consideran que también puede ser mayor que dos (lo que supone que una hebra tiene una probabilidad significativa de realizar dos o más síntesis durante un ciclo), y sería aceptable hasta 2,3. Se puede explicar de dos formas:
Entonces, dos escuelas chocan, con argumentos experimentales de apoyo. Se considera que esta eficiencia es una constante para cada amplicón en un protocolo experimental dado. El otro considera que siempre varía de forma significativa y que es necesario volver a medirlo constantemente. Cabe señalar que es muy difícil saber si una variación en la eficiencia de la PCR observada proviene de la propia naturaleza de este método, de una variación en el protocolo experimental (falta de reproducibilidad de los reactivos o manipulación) o una variación en los datos. adquisición (variaciones en la fluorescencia, diferentes canales de lectura, sesgo en el análisis matemático). También es muy difícil tener la certeza de que la eficiencia utilizada (medida en cada experimento o no) sea efectivamente la que tuvo lugar en la muestra a calibrar (ver PCR cuantitativa ).
Los acrónimos y nombres en inglés se dan entre paréntesis.
Multiplex PCR ( multiplex PCR ) es un protocolo para amplificar más de un amplicón a la vez, mediante el uso de al menos una reacción de PCR de tres cebadores. Entonces, los productos de PCR solo serán competitivos para la polimerasa, los dNTP y, opcionalmente, el marcador de ADN. También es posible amplificar diferentes tipos de ADN reconocidos por el mismo par de cebadores, como los imitadores. La PCR multiplex se puede realizar en el punto final (los productos de la PCR generalmente se diferencian por su tamaño o la presencia de un sitio de restricción) o en tiempo real (cada producto se mide mediante una sonda específica acoplada a un fluoróforo cuyo espectro de emisión es diferente de otros). Sus aplicaciones cualitativas son numerosas (detección de cepas virales, mutaciones, etc.) pero su aspecto cuantitativo no es unánime, a pesar de la fuerte presión industrial por este lucrativo mercado.
La meta-PCR es un método que permite dar una molécula de ADN sintético que comprende cualquier combinación de ADN amplificable por PCR en cualquier orden. Se realiza en un solo tubo y consta de dos pasos de PCR diferentes separados por un ciclo de descongelación para eliminar la actividad de la polimerasa residual. La meta-PCR se puede utilizar para aumentar el rendimiento de los métodos de escaneo y escaneo de mutaciones.
La PCR anidada , PCR pull o PCR anidada (PCR anidada ) es una PCR en dos pasos sucesivos, con dos pares de cebadores diferentes, las segundas secuencias de unión ubicadas dentro del primer amplicón. Esta técnica se utilizó inicialmente para reducir el riesgo de contaminación (el producto final tenía que poder interactuar con dos pares de cebadores, por lo tanto, dos niveles de especificidad). Ahora es ampliamente utilizado por virólogos que trabajan con virus de ARN que pueden tener una alta mutabilidad. El primer par de cebadores está diseñado para poder enganchar las pocas partes estables del genoma viral, el segundo para identificar el subtipo. También permite una mejor sensibilidad del resultado.
Es una amplificación por PCR en presencia de una pequeña cantidad de uno de los cebadores. Permite la secuenciación directa de los fragmentos amplificados. Durante los primeros 20 a 25 ciclos, se genera ADN bicatenario, hasta que se agota el cebador limitante, y se produce ADN monocatenario durante los últimos 5 a 10 ciclos. Las proporciones de cebadores usados son 50 pmol / 1-5 pmoles / 100 µL (1-3 pmoles monocatenarios después de 30 ciclos).
La PCR entrelazada asimétrica térmica ( TAIL-PCR o PCR entrelazada asimétrica térmica ) es un protocolo complejo que combina los principios de la PCR anidada, la PCR asimétrica por la Tm de los cebadores, la sucesión de varios tipos de ciclos que favorecen la hibridación de tal o cual cebador. y cebadores degenerados. El objetivo es obtener un amplicón final específico para una secuencia de ADN de la que generalmente solo se conoce un extremo con el fin de secuenciar la parte desconocida. Este método se usa ampliamente para caminar cromosomas o caracterizar secuencias variables de inmunoglobulinas.
Esta es una técnica que ayuda al desarrollo de un nuevo protocolo de PCR. Requiere termocicladores capaces de asegurar diferentes temperaturas, para un mismo paso, para las diferentes muestras. Se utiliza principalmente para optimizar la etapa de hibridación, en particular en PCR multiplex.
La PCR semicuantitativa se basa en la interrupción de la PCR en varios ciclos correspondientes a la fase estacionaria (la cantidad de ADN aumenta muy lentamente ya que hay poca plantilla de ADN), la fase exponencial (crecimiento rápido) y en la meseta (disminución en la cantidad de reactivos). Para una muestra, es posible estimar la cantidad inicial de ADN si hay una muestra en la que se conoce la cantidad de ADN (estándar). Su amplificación por PCR, a la interrupción de la reacción entre el 20 º y 30 º ciclo de PCR y la comparación de las intensidades de luz de la apuesta productos de PCR marcados posible estimar la cantidad inicial de ADN. Para dos muestras, es posible comparar su cantidad de ADN inicial deteniendo la PCR antes de la meseta de la PCR (<30 ciclos).
PCR en tiempo real o PCR cuantitativaLa PCR en tiempo real ( Real-time PCR ) es una revolución en el uso de la PCR, esta técnica consiste en medir la cantidad de ADN polimerizado en cada ciclo (tiempo real) con una etiqueta fluorescente . Permite por su principio realizar mediciones cuantitativas (explicando el nombre PCR cuantitativa, qPCR ) pero requiere termocicladores especiales . No debe confundirse con RT-PCR (PCR de transcripción inversa ), por lo que preferimos los nombres PCR cuantitativa o qPCR . Ciertos experimentos en PCR competitiva o PCR radioactiva permiten obtener medidas cuantitativas aprovechables.
PCR de punto finalEl punto final de la PCR ( punto final de la PCR ) es un término que surgió en oposición a la PCR en tiempo real . Se refiere a todos los intentos de cuantificación a partir del producto final de una reacción de PCR.
La reacción en cadena de la polimerasa touchdown ( Touchdown PCR ) es un protocolo utilizado para amplificar ADN mal representado y / o sometido a competencia en sus cebadores por productos pseudogenéticos. Consiste en tener una temperatura de hibridación muy alta durante los primeros ciclos para asegurar una alta rigurosidad y por tanto una amplificación específica. Una vez que la secuencia de interés se convierte en la mayoría frente a sus competidores, la temperatura de hibridación se reduce gradualmente para garantizar una mejor eficiencia de la PCR. La eficiencia no es constante a lo largo de la reacción, no es posible, hasta la fecha, poder obtener un resultado cuantitativo sin sesgo.
La colony PCR ( Colony PCR ) es un protocolo para amplificar de forma sencilla el ADN de microorganismos (bacterias, arqueas o levaduras) inoculando directamente la colonia en la mezcla de reacción de la PCR. Durante las primeras etapas de desnaturalización, las células se lisan y su ADN se libera en el medio de reacción. El ADN así liberado puede servir entonces como molde.
La PCR de colonias se utiliza en particular para verificar la eficacia de una transgénesis. Fue ampliamente utilizado durante la construcción de BAC en grandes programas de secuenciación .
La PCR de colonias se utiliza ampliamente en la investigación microbiológica para caracterizar filogenéticamente las cepas estudiadas.
La ep-PCR permite introducir errores en la secuencia copiada por la polimerasa. Esta técnica se puede utilizar, por ejemplo, para crear un gran número de mutantes que luego serán seleccionados (evolución dirigida). La polimerasa utilizada (la polimerasa Taq es naturalmente menos fiel que las polimerasas convencionales en la PCR) y las condiciones especiales (altas concentraciones de MgCl 2 o adición de MnCl 2 ) permiten aumentar la tasa de errores.
La RT-PCR ( reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ) es una técnica que combina la transcripción inversa (RT) seguida de la PCR. Sintetiza la hebra complementaria de un ARN con desoxirribonucleótidos utilizando una ADN polimerasa dependiente de ARN ( transcriptasa inversa ). Este cDNA generalmente está destinado a ser amplificado por PCR (siendo el cDNA más estable, permite más libertad que los RNA para los siguientes análisis).
Utilidad: se utiliza para el diagnóstico clínico, mediante medidas cuantitativas mediante PCR en tiempo real (estudio de cargas virales en virus ARN) y mediante medidas cualitativas (análisis del producto de expresión génica). También puede facilitar la secuenciación de genes grandes.
La transcripción inversa sigue siendo delicada (baja reproducibilidad; fragilidad del ARN, contaminación frecuente por ADN. A veces es necesaria una amplificación específica (si el medio contiene secuencias homólogas en cantidades mucho mayores que las de la secuencia de interés). La elección de cebadores de PCR y El cumplimiento de las normas internas o externas suele ser de gran importancia.
RT-PCR de un solo pasoEl paso a de RT-PCR (RT-PCR de un solo paso ) es un protocolo que mezcla los reactivos RT y PCR para que ambos pasos se puedan realizar sin tener que abrir el tubo. Esto permite reducir el riesgo de contaminación o inversión de la muestra, pero es más difícil optimizar el medio de reacción para cada paso. Esto además induce un riesgo de sesgo para normalizar el paso de RT porque implica el uso de PCR multiplex.
RT-PCR in situLa RT-PCR in situ es una metodología que consiste en realizar la RT-PCR no sobre moléculas en solución sino sobre cortes histológicos. Aunque los resultados son solo semicuantitativos, también proporcionan información sobre la ubicación de las transcripciones en el tejido.
RT-PCR cuantitativaLa RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) es una técnica para poder cuantificar un tipo de ARN originalmente presente en una muestra. Este término designa el uso de dos técnicas en sucesión, la transcripción inversa seguida de PCR en tiempo real. Objetivo principal de la mayoría de los biólogos, suscita vivas controversias en cuanto al uso de calibradores externos o internos (gen del hogar). Con la excepción de protocolos complejos que utilizan calibradores externos homólogos competitivos, solo permite la cuantificación relativa.
RT-PCR en una célulaLa RT-PCR de célula única ( RT-PCR de célula única ) es una metodología utilizada para estudiar las transcripciones de una sola célula, obtenidas por parche-clamp, microdisección láser o clasificación celular por actividad de fluorescencia (FACS en inglés para clasificación de células activadas por fluorescencia). ). Esta precisión puede ser necesaria cuando el tejido no es homogéneo (células tumorales, capas de células bien diferenciadas, etc.) pero la cuantificación será menos precisa debido a una amplificación de los efectos estocásticos y por lo tanto requiere una multiplicación de las medidas.
Otra técnica de amplificación isotérmica: "polimerización de ácidos nucleicos para apoptosis controlada". Los autores afirman que esta técnica podría implementarse en células vivas, y así tratar diversas patologías (VIH, malaria, cánceres, etc.) pero estas afirmaciones no han sido corroboradas por ningún otro equipo por el momento.
TP-PCR (TP significa Triplet Repeat cebado ), una variante compleja de PCR, fue desarrollada por Jon Warner en 1996 y se utiliza en amplificaciones de genes con tripletes repetidos, como en el caso de la distrofia miotónica, de Steinert . La combinación de secuenciación por PCR no se puede utilizar en estos casos porque la polimerasa Taq comete errores de replicación.
La amplificación dependiente de helicasa ( amplificación dependiente de helicasa , HDA ) es una técnica reciente cercana a la PCR, donde la deshibridación inducida por temperatura es proporcionada por una helicasa.
La PCR permite un diagnóstico rápido y altamente específico de enfermedades infecciosas causadas por bacterias o virus. La PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento, como micobacterias , bacterias anaerobias o virus a partir de ensayos de cultivo de tejidos y modelos animales. La base de las aplicaciones de diagnóstico de la PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de cepas no patógenas de cepas patógenas sobre la base de genes específicos.
La caracterización y detección de organismos infecciosos ha sido revolucionada por la PCR de la siguiente manera:
El virus de la inmunodeficiencia humana (o VIH ) es un objetivo difícil de encontrar y erradicar. Las primeras pruebas de infección se basaron en la presencia de anticuerpos contra el virus en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los anticuerpos no aparecen hasta varias semanas después de la infección, los anticuerpos maternos enmascaran la infección del recién nacido y los agentes terapéuticos para combatir la infección no afectan a los anticuerpos. Las pruebas de PCR se han desarrollado para poder detectar cargas virales bajas del orden de un genoma viral entre el ADN de más de 50.000 células huésped. Las infecciones se pueden detectar antes, la sangre donada se puede analizar directamente para detectar el virus, los recién nacidos pueden someterse a pruebas de infección de inmediato y los efectos de los tratamientos antivirales se pueden cuantificar.
Algunos organismos patógenos, como la tuberculosis , son difíciles de recolectar de los pacientes y se desarrollan lentamente en el laboratorio. Las pruebas basadas en PCR pueden detectar una pequeña cantidad de organismos patógenos (vivos o muertos) en las muestras. También se puede utilizar un análisis genético detallado para detectar la resistencia a los antibióticos, lo que permite un tratamiento inmediato y eficaz. Los efectos de la terapia con antibióticos también se pueden evaluar de inmediato.
La propagación de un organismo patógeno a través de poblaciones de animales domésticos o salvajes se puede controlar mediante pruebas de PCR. En muchos casos, se puede detectar y controlar la aparición de nuevos subtipos virulentos. Los subtipos de un organismo responsable de brotes anteriores también se pueden determinar mediante PCR.
El ADN viral puede detectarse mediante PCR. Los cebadores utilizados deben ser específicos de las secuencias diana en el ADN de un virus, y la PCR puede usarse para ensayos de diagnóstico o secuenciación de ADN del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite la detección del virus poco después de la infección e incluso antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad. Esta detección temprana puede brindar a los médicos una opción más amplia de tratamiento. La cantidad de virus ( carga viral ) en un paciente también se puede cuantificar mediante técnicas de cuantificación de ADN basadas en PCR. Por ejemplo, se utiliza una variante de PCR (RT-PCR) para detectar el genoma viral de la enfermedad por coronavirus 2019 .
Enfermedades como la tos ferina son causadas por la bacteria Bordetella pertussis. Esta bacteria causa una infección respiratoria aguda grave que afecta a varios animales y humanos y resulta en la muerte de muchos niños pequeños. La toxina de la tos ferina es una proteína exotoxina que se une a los receptores celulares mediante dos dímeros y reacciona con diferentes tipos de células, como los linfocitos T, que desempeñan un papel en la inmunidad celular. La PCR es una herramienta de prueba importante que puede detectar secuencias en el gen de la toxina pertussis. Debido a que la PCR tiene una alta sensibilidad a las toxinas y un tiempo de respuesta rápido, es muy eficaz para diagnosticar la tos ferina en comparación con el cultivo.