Transfección

El proceso de transferencia de genes, es decir, la introducción de material genético exógeno en células eucariotas , que no utiliza un virus como vector , se denomina transfección , en contraposición a transducción . Tenga en cuenta que el término "transfección" es bastante análogo al proceso de transformación bacteriana, pero este término no se ha aplicado a las células animales, debido a su asociación con un fenotipo alterado y crecimiento anárquico (en inglés simple, una etapa precancerosa).

Por lo general, se realiza mediante la apertura transitoria de los poros en las células para permitir la entrada de moléculas extracelulares, como un ADN superenrollado de plásmido , un ARN de interferencia pequeño u otro.

Las células manipuladas para aceptar ADN extraño (células con poros) se denominan "células competentes" ( células competentes ).

Métodos

Existen diferentes métodos para introducir ADN exógeno en una célula .

• Uno de los más convencionales y menos costosos, pero también menos confiables, es la transfección por fosfato de calcio , descubierto por S. Bacchetti y Graham FL en 1977. Una solución salina tamponada HEPES (solución salina tamponada con HEPES - HeBS) doblemente concentrada y que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el ADN a transfectar. Cuando se combinan estas dos soluciones, se forma un fino precipitado de fosfato cálcico, que une el ADN a transfectar en su superficie. A continuación, se añade la suspensión que contiene el precipitado a las células que se van a transfectar (normalmente un cultivo de células monocapa ). Mediante un proceso que no se comprende completamente, las células incorporan el precipitado que contiene ADN (los iones Ca 2+ enmascaran la polaridad negativa del ADN y le permiten ingresar a la célula).
  La transfección con fosfato de calcio se emplea particularmente con células 293 para proporcionar transfecciones transitorias.
• Un método muy eficaz es la inclusión del ADN a transfectar en liposomas , es decir, micelas que tienen propiedades estructurales similares a las de las membranas celulares, y les permite fusionarse eficazmente con ellas, liberando el ADN en la célula. Para las células eucariotas se utiliza la transfección a base de lípidos y policationes, debido a la mayor sensibilidad de las células.
• Otros métodos utilizan agentes policatiónicos altamente ramificados, llamados dendrímeros , como polietilenimina (PEI), para unir el ADN y transportarlo al interior de la célula.
  El policatión se une a los fosfatos negativos en el ADN y lo abarca por completo. El complejo formado es positivo en general y podrá unirse a los polisacáridos de la membrana plasmática, que son negativos. De Tris , a menudo incluido en la solución de transfección, mejora la permeabilidad de la membrana.
  Una vez adherido a la membrana, el complejo se endocitosa y se envía al endosoma . Además, la polietilenimina tiene propiedades únicas de una esponja de protones, capturando protones del lisosoma cuando se fusiona con el endosoma, inactivando así las hidrolasas ácidas que pueden degradar el ADN.
  En el caso de DEAE-Dextran, la captación de protones lisosomales está asegurada por un agente lisosomotrópico ( cloroquina ).
  Mediante un proceso aún poco conocido, el complejo ADN-policatión abandona el endosoma y se transloca al núcleo, donde se expresa (transfección transitoria, cf. infra ) o se integra en el genoma y luego se expresa (transfección estable, cf. infra ) .
• Otros utilizan la electroporación , el choque térmico y las propiedades especiales de reactivos como GeneCellin .
• Un enfoque directo de la transfección es el sistema de pistola de genes , en el que el ADN se acopla a una nanopartícula de un sólido inerte (generalmente oro), que luego se "dispara" ( dispara ) directamente en el núcleo de las células.
• La magnetofección es un método de transfección que utiliza campos magnéticos para concentrar partículas que contienen el ácido nucleico y la muestra en el útero para apuntar a células del cuerpo. Este método intenta unir las ventajas de los métodos de transfección bioquímicos ( lípidos catiónicos o átomos de polímero) y físicos ( electroporación , biolística ) en un solo sistema, excluyendo sus inconvenientes (baja eficacia, toxicidad).

Transfección estable y transitoria

En la mayoría de las aplicaciones de transfección, es suficiente que el gen transfectado sea solo transitorio. Como el ADN introducido generalmente no se introduce en el genoma celular, normalmente se pierde a más tardar durante la mitosis celular. Si se desea que este gen permanezca en el genoma de las células madre así como en las células hijas, debe llevarse a cabo una transfección estable.

Para hacer esto, se cotransfecta otro gen. Este gen le da a la célula una ventaja selectiva, como la resistencia a una toxina determinada. Aunque el rendimiento es muy bajo, algunas células habrán translocado el ADN exógeno y lo habrán integrado en su genoma; si la toxina (a la que la célula se ha vuelto resistente) se agrega al medio de cultivo celular, solo las células transfectadas podrán proliferar , mientras que las demás morirán. Después de aplicar esta presión de selección durante unos pocos pases en cultivo, solo las células transfectadas de manera estable resisten y pueden continuar cultivándose.

Un agente comúnmente utilizado para lograr una transfección estable es G418 ( genetinein ), una toxina que puede ser neutralizada por el producto del gen de resistencia a la neomicina .

Bibliografía

• Bacchetti y Graham, PNAS , vol. 74, págs. 1590-94, disponible a través del NCBI [1] .

Notas y referencias

1. Plank C, Zelphati O, Mykhaylyk O, “  Entrega de ácido nucleico magnéticamente mejorada. Diez años de magnetofección-avances y perspectivas  ”, Adv. Drug Deliv. Rdo. , vol.  63, núms .  14-15,2011, p.  1300–31 ( PMID  21893135 , PMCID  7103316 , DOI  10.1016 / j.addr.2011.08.002 )

Enlace externo

• Protocolo de transfección celular