Espectrofotómetro

Un espectrofotómetro es un instrumento para realizar una medición espectrofotométrica . Un espectrómetro , o espectroscopio , es un dispositivo que permite realizar una medición espectrométrica de la absorbancia de una solución a una determinada longitud de onda o sobre una determinada región del espectro .

Principio

Según la ley de Beer-Lambert , la absorbancia de una solución es proporcional a la concentración de sustancias en solución, siempre que se encuentre en la longitud de onda a la que la sustancia absorbe los rayos de luz. Es por eso que la longitud de onda se ajusta según la sustancia cuya concentración queremos conocer.

• Según la ley de Beer-Lambert, la absorbancia es función de la concentración C de la solución, el coeficiente de absorción molar y la longitud de la solución que pasa por L.Aλ{\ Displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ Displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Aλ=-Iniciar sesión10⁡II0=ελ⋅ℓ⋅VS{\ Displaystyle A _ {\ lambda} = - \ log _ {10} {\ frac {I} {I_ {0}}} = \ varepsilon _ {\ lambda} \ cdot \ ell \ cdot C}

II0{\ Displaystyle {\ frac {I} {I_ {0}}}}

• Tenga en cuenta que y son una función de la longitud de onda de trabajo, se elige en función de los espectros de absorbancia.Aλ{\ Displaystyle A _ {\ lambda}}ελ{\ Displaystyle \ varepsilon _ {\ lambda}}

Aquí los dos espectros se superponen, para lograrlos de forma independiente medimos la absorbancia de una solución de NAD + (respectivamente de NADH, H + ) a diferentes longitudes de onda (en igualdad de condiciones).

La longitud de onda de absorbancia máxima aquí es max = 260  nm para las dos moléculas. Por tanto, será preferible trabajar en esta longitud de onda. Por otro lado, si queremos analizar NADH, H + durante una reacción enzimática donde NAD + se reduce a NADH, H + por ejemplo, es más sensato trabajar a = 340  nm porque aquí solo medimos NADH, H + porque la absorbancia de NAD + es cero incluso si está presente en la mezcla. λ{\ Displaystyle \ lambda}λ{\ Displaystyle \ lambda}

Los espectrómetros de infrarrojos (IR) se utilizan principalmente para la identificación. Se puede decir que, en la práctica, los espectrómetros UV-visible se utilizan para análisis cuantitativos mientras que los espectrómetros IR son instrumentos cualitativos. Ambos utilizan principios ópticos similares, pero la frecuencia del espectrómetro de infrarrojos escanea la muestra.

Galería:

• Espectrómetro de laboratorio (tapa abierta).

• Espectrómetro de laboratorio (cerrado).

• Otro modelo.

• Espectrómetro de mano para medir el color (a menudo expresado en el sistema L * a * b * ) de una superficie.

El espectrómetro UV-visible (UV: ultravioleta) incluye:

• una fuente o fuentes de luz  : luz blanca para medición en el espectro visible ( luz policromática ) y / o luz ultravioleta.
  • La lámpara UV es generalmente del tipo deuterio (rango de 195 a 380  nm , vida de la lámpara de 1000  h , por ejemplo).
  • La lámpara visible es generalmente de tipo halógeno (rango de 320 a 1000  nm , vida útil de 500  h , por ejemplo).
  • También hay espectrómetros de lámpara de xenón; (rango de 190 a 1100  nm )
• un monocromador formado por una red que difracta la luz de la fuente. Permite seleccionar la longitud de onda de la luz que atravesará la solución a ensayar;
• una ranura de ancho fijo o variable para ajustar el ancho de banda;
• un portacubetas que permite que la solución a analizar se mantenga a la temperatura deseada, esta temperatura se mantiene mediante un circuito de agua o un efecto Peltier . Este mantenimiento a una temperatura fija es muy útil en medidas de cinética enzimática , de hecho, la velocidad de reacción depende de la temperatura;
• una cubeta transparente en la que se coloca la solución a estudiar. Dependiendo de la calidad y cantidad de la muestra, existen diferentes cubetas, generalmente de plástico (espectro visible, UV cercano) o de cuarzo (UV, pero cubetas muy caras).

El solvente y el (los) reactivo (s) utilizado (s) no siempre son transparentes, es obligatorio realizar un "blanco" o indicador de compensación, es decir una puesta a cero del dispositivo (tara), colocando solo el solvente y el reactivo ( s) utilizado en la cubeta, antes de la medición de la cubeta que contiene la muestra, para cada longitud de onda estudiada.
Los diseños de investigación son generalmente de doble haz y usan dos cubetas, la cubeta de referencia que contiene el solvente y reactivo (s), y la cubeta que contiene la muestra (con solvente y reactivo (s)). A continuación, se resta automáticamente el líquido de la cubeta de referencia (función de cero automático);

• una célula fotoeléctrica , restaurando una corriente proporcional al número de fotones recibidos. En modelos recientes, el detector de tipo fotodiodo único a veces se reemplaza por una matriz de CCD o una matriz de diodos (cada celda sensible recibe un color fijo). Los modelos más sensibles utilizan un fotomultiplicador o detector tipo PMT;
• un detector electrónico cuya respuesta es proporcional a esta corriente eléctrica y permite una medida relativa de la intensidad de la luz.

La espectrometría se usa principalmente para determinar la concentración de una solución de tinte (un proceso llamado ensayo colorimétrico ).

Áreas de aplicación

En biologia

• El espectrómetro se utiliza al realizar la prueba MTT .
• En biología molecular , se utiliza durante la extracción de ADN , para cuantificar el ADN y determinar su pureza. Se utiliza la longitud de onda de 260  nm , que es el área de máxima absorbancia de los ácidos nucleicos. Una segunda medición a 280  nm permite comprobar la pureza de la extracción, es decir, la presencia de proteínas residuales en la solución de ADN.

Para una solución de ADN purificada, la relación R debe estar entre 1.8 y 2. Si R es significativamente menor que 1.8, entonces las proteínas probablemente están contaminando la solución. Mayor que 2, esta relación indica una probable contaminación por ARN.

La concentración de ADN se puede calcular a partir de la medición a 260  nm utilizando un factor de correlación:

• ADN bicatenario: 1 Abs = 50 ng / µl
• ADN monocatenario: 33 ng / µl (como ARN monocatenario)
• ARN: 1 Abs = 40 ng / µl.

En bioquímica , se utiliza durante la purificación de proteínas, para cuantificarlas (longitud de onda 280  nm ) y para determinar su nivel de pureza (longitud de onda 260  nm ).

En medicina

Análisis cinético de diferentes enzimas sanguíneas, determinación de fosfatasa alcalina: colestasa, lactato deshidrogenasa: infarto de miocardio, hemólisis.

En física

El análisis de la luz permite determinar los componentes químicos que provocan la emisión de luz: por ejemplo, la composición química de las estrellas.

En Quimica

El análisis de la absorción de soluciones a una determinada longitud de onda permite la dosificación de estas soluciones según la ley de Beer-Lambert (la concentración es proporcional al logaritmo de la absorción de luz). Por tanto, existe una relación directa entre la cantidad de luz absorbida y la concentración de compuesto químico en la solución. El seguimiento de la absorción a lo largo del tiempo es un método para caracterizar la velocidad de las reacciones químicas (cinética).

Un barrido de frecuencia permite caracterizar las especies presentes en solución volviendo a la naturaleza de la transición energética considerada.

En las industrias gráficas

Se utiliza para medir colores con el fin de calibrar dispositivos de salida como trazadores .

Bibliografía

• Georges Bruhat , Optique , sexta edición, colección de cursos de referencia, Dunod, 2005, 1152 p.

Ver también

• Espectrofotometria
• espectrometria

Notas y referencias

1. Cf. G. Bruhat (2005), Óptica , sexta edición, Dunod: § Espectrofotometría.
2. Por homogeneidad con la unidad generalmente utilizada para el coeficiente de absorción molar, la longitud se expresa en cm. Es por eso que la mayoría de las cubetas están estandarizadas en L = 1  cm .