La mutagénesis es la inducción de una o más mutaciones en un genoma , de forma precisa y voluntaria. Este método se utiliza para modificar las estructuras de ADN , ARN y proteínas . Esta técnica de biología molecular fue desarrollada por Michael Smith en 1978. Aparentemente, la idea de mutagénesis dirigida al sitio se le ocurrió durante una conversación con Clyde Hutchison en 1976 en el Instituto de Cambridge en Inglaterra, cuando 'estaba trabajando en la preparación de oligonucleótidos para purificar fragmentos de ADN. Este importante descubrimiento le valió el Premio Nobel de Química en 1993 con Karry Mullis , el inventor de la reacción en cadena de la polimerasa .
Los métodos de mutagénesis dirigida al sitio se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las mutaciones se introducen utilizando cebadores oligonucleotídicos que se sintetizan de antemano. Estos cebadores son complementarios a la secuencia de tipo salvaje excepto por los nucleótidos que deben mutar. De hecho, la PCR no requiere una complementariedad estricta entre el cebador de nucleótidos y la secuencia de ADN diana. Al final de la reacción de PCR, las mutaciones se introducen en los productos y pueden ser de tres tipos:
1) Sustituciones: uno o más nucleótidos se reemplazan por el mismo número de nucleótidos diferentes.
2) Inserciones: se añaden uno o más nucleótidos a la secuencia diana.
3) Deleciones: se eliminan uno o más nucleótidos de la secuencia.
Uno de los primeros enfoques para la mutagénesis dirigida al sitio se basa en la extensión de superposición. Los cebadores complementarios se utilizan para generar fragmentos de ADN con extremos superpuestos mediante PCR. Estos fragmentos se combinan y su hibridación permite el alargamiento de la región de superposición. Las mutaciones se introducen de forma específica mediante cambios de nucleótidos en la secuencia de los cebadores.
En la práctica, se utilizan dos pares de cebadores para realizar tres reacciones de PCR. Los cebadores 1 y 2 llevan la mutación en su región 5 'y son complementarios entre sí. Los cebadores 3 y 4 delimitan el ADN diana a amplificar. La primera PCR se realiza con los cebadores 2 y 3 y permite amplificar la parte izquierda del ADN diana incluida la región mutada. La segunda PCR, realizada con los cebadores 1 y 4, produce la parte derecha del ADN diana, incluida la región mutada. Purificados, mezclados y desnaturalizados, los productos de estas dos PCR pueden hibridar por la región mutada que les es común. A continuación, una tercera PCR con los oligonucleótidos 3 y 4 permite obtener el ADN diana completo con la mutación.
Otros enfoques importantes incluyen la mutagénesis dirigida al sitio del vector QuickChange.
Son posibles muchas técnicas a través de la PCR :