La desnaturalización del ADN o fusión del ADN , es un proceso que lleva a transformar una doble hebra de ADN en dos hebras simples rompiendo los enlaces de hidrógeno entre las nucleobases de dos cadenas complementarias del ADN.
Esta desnaturalización se puede realizar in vitro sometiendo el ADN a cualquier agente químico o físico capaz de desestabilizar los enlaces de hidrógeno, como pH, temperatura, determinados disolventes, altas concentraciones iónicas, agentes alcalinos, etc.
A diferencia de la desnaturalización de las proteínas , la del ADN es perfectamente reversible, durante un retorno suficientemente lento a las condiciones iniciales: las bases reaparecen de forma natural. Es la renaturalización, la re-asociación de las dos cadenas de ADN que se recombinan en una sola molécula de doble cadena.
La desnaturalización se puede seguir fácilmente mediante espectroscopía de absorción UV a 260 nm gracias a la existencia de un efecto hipercrómico . El coeficiente de extinción molar ε de la molécula aumenta en un factor de aproximadamente 1,4 durante la transición bicatenaria → monocatenaria. Esto se debe al cambio en el entorno de las bases de ADN que pasan de un estado apilado en el dúplex a un estado desordenado, expuestas al disolvente acuoso en la hebra única.
La estabilidad del dúplex formado por dos cadenas de ADN asociadas en una doble hélice se debe a la suma de cuatro efectos antagónicos:
El pH, la fuerza iónica (contribución de iones), la actividad del agua (Aw) pueden modular la fuerza de repelencia. El coeficiente de Chargaff (% GC), la longitud de la molécula, la presencia de agentes desnaturalizantes como urea, formamida, influyen en la fuerza de estabilización de los enlaces de hidrógeno.
La medición de la temperatura de fusión Tm ( t emperatura de m Elting ) es una forma buena de resumir la influencia de los diferentes parámetros mencionados en la estabilidad del ADN:
Si el parámetro (abajo) aumenta | incrementa : | estabiliza el ADN y aumenta la Tm? |
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el coeficiente de Chargaff% GC | el número de enlaces de hidrógeno | sí |
el pH que ioniza los fosfatos | fuerza de repulsión electrostática | no → desnaturalizante |
concentración de cationes, fuerza iónica | neutraliza cargas | sí → efecto estabilizador |
concentración de urea, formamida | competidor de enlaces de hidrógeno entre bases | no → desnaturalizante |
Concentración de ADN, actividad del agua | afecta la constante dieléctrica | sí → efecto estabilizador |
la longitud de la molécula de ADN | el número de áreas ricas en GC | sí → efecto estabilizador |
La temperatura a la que se desnaturaliza la mitad de las moléculas de ADN se denomina temperatura de fusión molecular . Podemos seguir este proceso de desnaturalización espectroscópicamente y medir la temperatura de fusión, gracias al efecto hipercrómico . Esto corresponde a un aumento en la absorción de UV durante el pasaje dúplex → monocatenario.
Cuando la temperatura desciende, las cadenas complementarias se reasocian de dos en dos con la reaparición de los enlaces H. La composición de nucleótidos de la cadena tiene un efecto sobre la temperatura de fusión: cadenas que contienen muchas bases C y G (que involucran enlaces 3 H entre los nucleótidos uno frente al otro en ambas hebras) será más difícil de desnaturalizar que las cadenas que contienen más bases A y T (2 enlaces).
La desnaturalización del ADN se puede realizar con un termociclador .