La microscopía crioelectrónica (crio-EM) corresponde a una técnica particular para la preparación de muestras biológicas empleada en microscopía electrónica de transmisión . Desarrollada a principios de la década de 1980, esta técnica reduce el daño por irradiación causado por el haz de electrones. También permite preservar la morfología y estructura de las muestras.
Superando la presencia de colorante o fijador químico, esta técnica consiste en congelar muy rápidamente muestras biológicas en forma hidratada en etano líquido, para así congelarlas en su estado nativo en hielo amorfo, es decir, no cristalino.
Con el continuo desarrollo de nuevas generaciones de microscopios electrónicos y sistemas de adquisición de datos (en particular el desarrollo de cámaras de detección directa de electrones), cryo-ME ahora permite en algunos casos obtener resultados similares o incluso mejores a los de la radiografía cristalográfica para la resolución de estructuras tridimensionales (3D) de objetos biológicos.
Dado que los electrones interactúan muy fuertemente con la materia, se requiere un vacío extremadamente alto en toda la columna del microscopio. Cualquier muestra biológica (en solución) colocada directamente en este ambiente sería inmediatamente deshidratada y su estructura seriamente dañada. Además, la muestra no debe sufrir un cambio irreversible bajo la acción del rayo, lo que significa en particular la ausencia de efectos de carga eléctrica o la reducción de daños por irradiación. Para sortear estas limitaciones, se han desarrollado métodos de preparación específicos, incluido cryo-ME.
El 4 de octubre de 2017, el Premio Nobel de Química fue otorgado conjuntamente a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson , "por desarrollar microscopía crioelectrónica para la determinación de estructuras de alta resolución de biomoléculas en solución".
Cryo-ME permite realizar estudios estructurales de complejos macromoleculares biológicos con un número de limitaciones mucho menor que para la difracción de rayos X. A diferencia de otras técnicas de preparación (incluida la tinción negativa), no se utilizan colorantes ni productos químicos fijadores. Además, el complejo macromolecular puede permanecer en un ambiente (tampón) cercano a sus condiciones fisiológicas (en términos de pH y concentración de sal). La congelación rápida de muestras en etano líquido ( -160 ° C ) las congela en su estado nativo en hielo amorfo. Las imágenes obtenidas son proyecciones 2D de todos los objetos congelados, esto permite acceder a la estructura interna de macromoléculas complejas. El uso de crio-microscopía (manipulación y mantenimiento de muestras a baja temperatura) aumenta la vida útil de la muestra bajo el haz de electrones en un factor de dos o tres.
En el caso de muestras biológicas delgadas (partículas aisladas <500 nm ), se depositan unos μL de muestra en una rejilla de microscopía electrónica (rejilla cubierta con una membrana con orificios de carbono, oro, etc.). Antes de congelar, el material sobrante se absorbe con papel de filtro. A continuación, la rejilla se sumerge muy rápidamente (velocidad superior a 2 m / s ) en etano líquido. La muestra, en su estado original, terminará congelada en los agujeros dentro de una capa de hielo amorfo muy delgado. Una vez transferida al microscopio, se observa la rejilla mantenida a la temperatura del nitrógeno líquido ( -185 ° C ). Para limitar el daño por irradiación, se utilizan dosis bajas de electrones. Las imágenes obtenidas son proyecciones de todo el espesor de la muestra pero solo tienen un contraste muy bajo (indirectamente relacionado con la diferencia de densidad entre una proteína y el hielo vítreo, 1,3 g / mL vs 1 g / mL ). Entonces, para determinar la estructura de la muestra, un análisis de imagen es esencial. El principio general consiste en primer lugar en añadir imágenes idénticas de bajo contraste para promediar el ruido presente y obtener una mejor relación señal / ruido. En segundo lugar, estos promedios que representan vistas de la muestra desde diferentes ángulos se pueden combinar matemáticamente para calcular la estructura tridimensional del objeto.
Las muestras biológicas, como células o bacterias (> 1 μm ), pueden observarse mediante crio-ME como secciones hidratadas congeladas. Las muestras primero se crio-fijan (generalmente por congelación a alta presión), luego se cortan en secciones delgadas (secciones de 40 a 200 nm de espesor) usando un crio- ultramicrótomo . La observación y la toma de imágenes se realizan posteriormente como para las muestras hidratadas congeladas.
En Francia, existen varios centros especializados en crio-microscopía electrónica y observación de muestras biológicas. La mayoría de estos centros forman parte de infraestructuras nacionales e internacionales como GIS IBiSA , Frisbi e Instruct , accesibles a toda la comunidad científica.
http://www.iecb.u-bordeaux.fr/index.php/en/structural-biophysico-chemistry/electron-microscopy
https://www.ibisa.net/plateformes/detail.php?tri=Biologie%20structurale,%20biophysique&srch=&q=300
https://www.i2bc.paris-saclay.fr/spip.php?article277&lang=fr
https://frisbi.eu/centers/south-paris/cryo-electron-microscopy/
https://www.ibisa.net/plateformes/detail.php?tri=Biologie%20structurale,%20biophysique&srch=&q=581
https://www.isbg.fr/structural-analysis/cryo-electron-microscopy/?lang=fr
https://instruct-eric.eu/platform/electron-microscopy-grenoble-france/
https://frisbi.eu/centers/instruct-centre-france-2-ibs-isbg/electron-microscopy/
https://www.ibisa.net/plateformes/detail.php?tri=Biologie%20structurale,%20biophysique&srch=&q=60
http://www.afmb.univ-mrs.fr/microscopie-electronique
https://frisbi.eu/centers/afmb/cryo-electron-microscopy/
https://www.ibisa.net/plateformes/detail.php?tri=Biologie%20structurale,%20biophysique&srch=&q=156
http://www.cbs.cnrs.fr/index.php/fr/pibbs-em
https://www.ibisa.net/plateformes/detail.php?tri=Biologie%20structurale,%20biophysique&srch=&q=5
https://instruct-eric.eu/platform/electron-microscopy-strasbourg-france/
https://frisbi.eu/centers/instruct-center-france-1-igbmc/cryo-electron-microscopy/
https://www.ibisa.net/plateformes/detail.php?tri=Biologie%20structurale,%20biophysique&srch=&q=69