La Citogenética es el estudio de los fenómenos genéticos a nivel celular , es decir a nivel de cromosomas sin necesidad de extraer ADN: anomalías cromosómicas (número y estructura), recombinación cromosómica, etc. Las técnicas usadas están logrando principalmente cariotipo , los métodos de FISH ( F luorescent I n- S itu H ybridation: la hibridación in situ con sondas fluorescentes), el uso de chip de ADN .
Después de las primeras observaciones de cromosomas en 1880 por Flemming, la genética siguió siendo una ciencia marginal durante mucho tiempo, por lo que no fue hasta 1956 que Tjio y Levan establecieron correctamente el número de cromosomas de la especie humana en 46, a partir de tejidos. culturas, y con la idea de introducir un choque hipotónico para mejorar la propagación cromosómica. Las técnicas utilizadas hoy para el establecimiento del cariotipo clásico han cambiado poco en comparación con este período. En 1959, Jérôme Lejeune y sus colaboradores describieron la primera anomalía cromosómica vinculada a una patología, la trisomía 21 . A esto le siguió en el mismo año la descripción de Jacobs y Strong de la primera anomalía cromosómica sexual, con la fórmula XXY, en el síndrome de Klinefelter. En 1960, se estableció en Denver la primera nomenclatura internacional para la clasificación de cromosomas, basada en su tamaño y la posición de su centrómero. Las causas de los síndromes de malformaciones cromosómicas más frecuentes se descubrieron entonces muy rápidamente: síndrome de Turner, trisomías 13 y 18 ... En 1960, Nowell y Hungerford identificaron también la primera anomalía cromosómica en una enfermedad maligna, por tanto adquirida, la Cromosoma Filadelfia , inicialmente descrito como un 22 eliminado, que Rowley demostró más tarde que era el resultado de una translocación t (9; 22).
La citogenética permite evaluar la constitución cromosómica de un individuo, es decir, la composición cromosómica de las células de un individuo. Por ejemplo, un hombre normal tiene 46, XY, es decir, tiene:
◊ 46 cromosomas por célula (23 pares)
◊ incluyendo 2 gonosomas (X e Y); estos son los dos cromosomas sexuales y 44 autosomas.
El análisis de los cromosomas por técnicas citogenéticas generalmente resulta de análisis previamente realizados y que muestran un riesgo de ciertas enfermedades. La primera técnica citogenética es la realización de cariotipos, cuyos cromosomas se tiñen con mayor frecuencia con el tinte G. Luego apareció el FISH (ver más abajo), lo que permite una resolución mucho mejor en un tiempo más corto. Por último, apareció recientemente la hibridación comparativa o aCGH para la hibridación genómica comparativa de matrices.
La denominada técnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) es una técnica que permite revelar por fluorescencia gracias a sondas de ADN de las secuencias de los cromosomas. Esto permite identificar anomalías cromosómicas durante los análisis prenatales y posnatales. Cada análisis solo identifica una única anomalía, y es una técnica dirigida, las sondas utilizadas no se eligen al azar, sino que siguen análisis previos (de bioquímica en general).
Las células que se van a estudiar sufren un shock hipotónico (en solución salina, por ejemplo), lo que hace que entre agua en la célula. La célula así hinchada se debilita. Tome una gota de solución y colóquela en un portaobjetos. El choque rompe la membrana plasmática de las células, liberando el núcleo (para las células en interfase ) y los cromosomas (para las células en mitosis ) en el portaobjetos. Estos núcleos y cromosomas se unen al portaobjetos con metanol (deshidrata y aplana los núcleos) o paraformaldehído (que mantiene la forma del núcleo). Estos productos se utilizan de acuerdo con lo que se busca observar en el núcleo. Su uso es indiferente para los cromosomas.
Digestión de ARN y proteínasUn paso importante para obtener el portaobjetos es la digestión por ARNasa (una enzima que descompone el ARN ) de los ARN liberados cuando la célula estalla en el portaobjetos. De hecho, estos ARN podrían fijar sondas marcadas durante el paso de hibridación y emitir ruido durante la observación al microscopio. También podemos realizar una degradación controlada de las proteínas para hacer más accesible el ADN genómico a nuestras sondas y a los anticuerpos (paso de revelar las sondas). Para ello utilizamos proteinasa K o pepsina . Sin embargo, se debe tener cuidado de no usar estas proteasas en concentraciones demasiado altas o durante demasiado tiempo, ya que esto afectaría la forma de los cromosomas que serían irreconocibles al microscopio.
AnálisisLos portaobjetos se leen utilizando un escáner de biochip como InnoScan 710 o Innopsys Innoscan 910 y luego se analizan con un software dedicado para correlacionar la fluorescencia adquirida con cualquier alteración genética.