La cromatografía en capa fina (TLC a English TLC cromatografía en capa fina ) es una técnica de cromatografía plana en la que la fase móvil es líquida . Se utiliza comúnmente para separar componentes para análisis (TLC analítica) o purificación (TLC preparativa ).
Ella comprende :
El fenómeno de adsorción es preponderante (pero también hay partición si el disolvente es una mezcla) para las fases estacionarias polares. En el caso de las fases inversas , es decir hidrófobas, predomina el fenómeno de la cromatografía de partición .
Una placa TLC es un soporte de vidrio, aluminio o plástico sobre el que se ha extendido una fase estacionaria en una capa uniforme. El espesor de esta capa es del orden de 0,2 mm (200 μm ) para una placa analítica y de 1-3 mm para una placa preparativa . Antes del esparcimiento, la fase estacionaria es un polvo fino, por lo que debe mezclarse con un aglutinante que asegure una buena cohesión de la capa y una buena adherencia al soporte. Lo más frecuente es que se utilice un aglutinante inorgánico como yeso , yeso , sulfato de calcio hemihidrato o un aglutinante orgánico (por ejemplo, alcohol polivinílico), en particular cuando la fase estacionaria es hidrófoba .
A menudo se agrega un tinte fluorescente para permitir la detección de los productos en luz ultravioleta a 254 nm o 366 nm ; a esta longitud de onda, el tinte de la fase estacionaria emite una luz, generalmente verde, excepto en los lugares donde un producto absorbe la radiación UV que provoca la aparición de manchas oscuras.
En la actualidad, existen muchas fases estacionarias que son cada vez más eficientes y que permiten separaciones muy finas por lo que se habla, en este caso, de cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC en inglés).
La relación frontal (R f ) o factor de retención de un compuesto es la relación entre la distancia entre la línea de depósito y el compuesto y la distancia entre la línea de depósito y el frente del disolvente. Está entre 0 y 1, y es característico del compuesto, el material de la placa y el sistema eluyente.
El R f de los productos depende de su afinidad relativa por la fase estacionaria y la fase móvil. En la mayoría de los casos, la fase estacionaria es polar (sílice, alúmina, celulosa). Cuanto más polar sea un compuesto en sí, más afinidad tendrá por la fase estacionaria y, por lo tanto, más se retendrá en la placa. Cuanto más aumenta la polaridad del eluyente, más compite con la fase estacionaria y, dado que está en movimiento, más lleva consigo el compuesto.
El eluyentePara modular la polaridad del eluyente, generalmente se utiliza una mezcla de disolventes y se indica la relación en volumen de los disolventes utilizados, procurando que la suma de los volúmenes sea igual a 10 o 100; por ejemplo, una mezcla de cloroformo (8 ml) y acetato de etilo (2 ml) a menudo se denominará cloroformo / acetato de etilo 8/2 o 80/20 .
Orden relativo de la polaridad de una selección de disolventes puros desde el más polar al menos polar:
El siguiente ejemplo muestra los diferentes pasos del procedimiento para preparar, eluir y revelar placas de TLC mientras se monitorea el progreso de una reacción química. Se considera que la fase estacionaria es un gel de sílice estándar que tiene un indicador fluorescente.
Cada línea debe escribirse con lápiz, porque las tintas de las plumillas o bolígrafos son solubles en la mayoría de eluyentes y por tanto distorsionarían la cromatografía.
Conclusión: algo está sucediendo durante esta reacción química. Se forman varios productos pero uno ( n o 2) parece claramente en la mayoría. Será necesario repetir una TLC un poco más tarde para seguir la desaparición de la mancha 4 (producto de partida) en la columna B (reacción en bruto), lo que significará que la reacción está completa. Luego, la cromatografía en columna permitirá aislar los distintos productos y realizar análisis más profundos para asegurar que el producto 2 sea efectivamente el producto esperado.
Enlace al sitio web del Thin Layer Chromatography Club: http://www.clubdeccm.com/PDF/Dyeing_Reagents_TLC.pdf Este documento PDF muy completo ofrece una descripción exhaustiva (respaldada por referencias bibliográficas) de 335 desarrolladores.
Se usa en forma de spray o por inmersión y esto produce una coloración amarillo / marrón de los productos oxidables sobre un fondo violeta / rosa. Se puede utilizar en placas de Alúmina y Sílice. La ventaja sobre otros productos reveladores es que no es necesario calentar (por lo que las placas se pueden revelar sobre plástico).
A veces se considera (erróneamente) que la vainillina como revelador es difícil de preparar. Es cierto que en algunos casos la solución se volverá violeta en unas pocas horas y quedará inutilizable. La razón es muy simple: cuando apareció este revelador, usábamos casi exclusivamente etanol al 96% que es el solvente para esta preparación. En la actualidad, utilizamos principalmente etanol absoluto (<0.02% de agua) para cualquier operación que requiera un solvente que contenga pocas impurezas, pero la presencia de agua (5-10%) es absolutamente esencial, necesaria para que el revelador permanezca estable. Por tanto, la receta actualizada es:
Este revelador se utiliza en spray o en remojo seguido de calentamiento a unos 200 ° C hasta que aparezcan las manchas.
Se puede observar que este tipo de revelado a menudo produce colores intensos en todo el espectro visible y que el color de una mancha es característico del compuesto presente. Por tanto, es posible:
Muy a menudo, las placas comerciales se cubren con un producto ( gel de sílice ), que perturba la revelación. De hecho, a menudo nos encontramos con una línea al nivel de esta frente. A menudo se considera (erróneamente) como la marca de disolventes utilizada. Pero un método simple para evitar este fenómeno es hacer que la placa migre completamente al sistema de solvente que se usará posteriormente y dejar que se seque bien antes de usarla. La principal ventaja de esta técnica es que permite ver más claramente si los productos han migrado sin ser retenidos por la fase sólida.
Un depósito ideal es una línea fina hecha de una vez. Sin embargo, dependiendo del origen del producto depositado, esto no es necesariamente fácil. Es posible usar un solvente fuerte (acetona / metanol 90:10 sobre sílice por ejemplo) que se usará para hacer migrar toda la fracción depositada, y esto solo en unos pocos milímetros. Por lo tanto, a menudo nos encontramos con una línea muy clara que permite discriminar más fácilmente entre productos que tienen comportamientos relativamente similares en el plato. Por otro lado, es necesario asegurar el secado completo de la placa antes de continuar con el desarrollo.
Las placas con respaldo flexible están hechas para cortarse. Sin embargo, la fase sólida se desprende fácilmente de este soporte, y en el momento del corte se desmorona provocando así diversos artefactos durante el desarrollo de la placa (efectos de borde en los que un lado de la placa migrará más rápido que el otro). Para evitar esto, al cortar, puede inclinar las tijeras a 45 ° en el sentido de las agujas del reloj (para tijeras diestras, al revés para personas zurdas) en el eje del corte.
TLC de una tinta negra (una tinta negra es una mezcla de tintas de varios colores)
La cromatografía bidimensional de capa fina (o TLC-2D) tiene dos aplicaciones principales:
Para separar mezclas complejas de sustancias similares, puede ser útil emplear cromatografía bidimensional . La cromatografía bidimensional en capa fina se lleva a cabo en dos etapas entre las que se cambia el disolvente y la placa se gira 90 °. Las interacciones desarrolladas por el nuevo disolvente serán diferentes, lo que modificará la separación en esta segunda dimensión y permitirá una mejor separación global.
Ciertos compuestos se degradan al entrar en contacto con la fase estacionaria y / o la mezcla de disolventes utilizada. Un método sencillo para detectar esta degradación es utilizar cromatografía bidimensional de capa fina.
Sobre un plato cuadrado, se coloca un poco de la solución a analizar en una esquina del plato aproximadamente a 1 cm de cada borde. Se lleva a cabo una primera elución tras la cual la placa se seca rápidamente. A continuación, se lleva a cabo una segunda elución a 90º de la primera con el mismo eluyente. Dado que la placa es cuadrada y el R f de un compuesto estable permanece igual de una elución a la siguiente, los productos estables aparecen en la diagonal. Por otro lado, los compuestos que se degradan aparecerán fuera de la diagonal porque los productos de degradación (que se forman durante y entre las eluciones) generalmente tienen un R f diferente del producto de partida.